FlashPack: 빠르고 간단하게 분리능이 좋은 nano column 만들기

Fused silica tubing 으로 nano column을 만드는 일은 종종 시간이 많이 걸립니다.  특히 packing이 완료되는데 걸리는 시간이 컬럼마다 다를때가 많습니다.  어쩔때는 하루종일 두었다가 다음날에 완료하는 경우가 있습니다.  보통 컬럼을 만들때 Tip부분이 잘 만들어지느냐에 따라 충진효율이 다를때가 있습니다. Tip의  구멍이 너무 작거나 모양이 좋지 않으면 고압력이 걸려서 지속적인 충진이 안됩니다.  또한 처음에 C18이 tip끝에 어떻게 충진되느냐에 따라서도 달라집니다.  C18 Materials이 처음에 Tip끝을 비정상적으로 막아버리게 되면 고압력이 발생하여 충진이 순조롭게 되지 않습니다.

 

 

2019년도에 "FlashPack" 을 제목으로 논문이 나왔습니다.  컬럼충진하는데 무슨 새로운 기술이 있어서 논문이 나왔는지 의아해 했습니다. 하지만 충진하는데 조금만 변화를 주어도 짧은 시간안에 좋은 컬럼을 만들수가 있습니다. 자세한 내용은 논문을 읽어보시면 됩니다.

 

 

Mol Cell Proteomics.  2019 Feb;18(2):383-390

 

이 논문을 근거로 현재 제가 컬럼을 충진하는 방법은 아래와 같습니다.

 

• C18 Materials : ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 2.4 µm
• Laser Puller: P-2000 Laser-Based Micropipette Puller
• Fused Silica Column: 75 µm ID, 360  µm OD.

 

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C18 solution 준비

HPLC 급 Methanol을 Vial에 담습니다.  기존의 방법 ( 2.5–25 mg/ml)과 다르게 아주 고농도의 C18 solution(50~100mg/mL)으로 낮은 높이로 채웁니다.  C18에용매가 잘 흡수되도록 잠시 둡니다.

Water bath에서 Sonication을 하여 균일하게 섞일수 있도록 합니다.  오랫동안 사용하지 않았을 경우에도 사용전에 sonication을 해줍니다.

 

 

Nano-column 준비

Fused silica tubing을 적절한 길이로 절단한후 중간부분을 gas tourch로 코팅을 벗깁니다. 그을린부분을  메탄올로 닦아내면 투명한 부분이 보입니다.

 

 

코팅이 벗겨진 투명한 부분이 Laser puller의 중간에 오도록 설치합니다. 양쪽의 단단히 조여서 컬럼이 흔들리지 않는것을 확인합니다. 만약 단단히 조여지지 않아서 느스하게 되면 기계가 제대로 작동하지 않습니다.

 

 

컬럼이 만들어지면 준비된 C18 solution으로 packing을 합니다.  논문에 나온것 처럼 아주 고농도로 만드는것이 중요합니다. 컬럼을 삽입하고 컬럼이 바닥에 닿는 느낌이 날때 약간만 위로 올려서 고정합니다.  준비가 완료되면 낮은 압력 (100 bar) 정도로 충진을 합니다.  아마 아주 빨리 충진되는것을 볼수 있습니다.  종종 r pressure를 켜자마다 컬럼이 다 충진됩니다. 그야말로 flash packing 입니다. 

 

 

 

실제 충진되어 분석하고 있는 컬럼 Tip의 모양입니다.  회사에서 판매하는 컬럼과 유사한 Tip 모양을 볼수 있습니다. 

 

 

Dionex nano UPLC에서 장착한후 압력을 확인해 보았습니다. 약 30 cm 길이의 컬럼에도  불구하고 300nL//min에서 300 bar 이하가 걸립니다.  Buffer A: H2O(0.1 % F.A.), Buffer B, 80 % ACN and 20% H2O (0.1% F.A)

 

 

 

실제 크로마토그램입니다. Total mouse brain 2 µg 을 120min으로 분석하였습니다. Peak의 tailing이 없이 좋은 분리능을 가집니다.  특별히 지저분한 시료가 아니라면 한달정도는 사용할수 있습니다.

 

 

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