No Peptide elution with a newly packed nano-column (Column coating)

Nano column 을 사용하시는 분은 대부분 아시는 내용이라 생각합니다. 새로 C18을  충전한 컬럼에서 BSA와 같은 standard peptide mixture가 나오지 않은 경우입니다. 그리고 몇번 더 주입하면 결국 정상적으로 나오게 됩니다.

 

C18은 아래 그림처럼 Octadecy chain 으로 구성되어 있습니다. 매우 Hydrophobic 한 성질을 가지고 있습니다.

 

 

  즉 C18 정지상이 처음으로 펩타이드와 결합할때 펩타이드들은 이 긴 chain 깊숙이 들어가서 아주 강한 hydrophobic interaction을  합니다. 이때 깊숙이 들어간 펩타이드는 C18와 아주 강하게 결합하여 더 이상 용리되지 않습니다.  소량 주입된 standard 펩타이드은 이 공간을 꽉 채우게 됩니다.  그리고 그 이후에 주입되는 펩타이드의 경우 더 이상 이 영역에서 결합하지 않게 됨으로 정상적으로 용리되게 됩니다.

 

그래서 보통 새로운 컬럼을 설치하면 여러번 주입하며 coating 을 시켜줍니다. 혹은 아주 complex 한 시료의 경우는 한번이면 충분합니다.

 

아래는 새로운 컬럼을 충진한후 100fmol BSA를 순차적으로 주입한 크로마토그램입니다.

첫번째는 예상대로 아무것도 나오지 않았습니다. 2번째에는 펩타이드가 나왔으며 오른쪽으로 많이 밀려있습니다.  새로 충전된 컬럼은 완벽하게 충진이 안되는 경우가 많습니다. UPLC를 통해 고압력으로 용매가 밀어주면 C18 resin이 다시 한번 더 충진이 됩니다. 이러한 이유로 처음에는 retention time에 변화가 생깁니다. 3번째부터는 정상적으로 나왔고 4번째는 3번째와 유사하게 재현성 있게 나왔습니다. 이제 분석을 위해서 컬럼이 준비되었습니다.