ETD-PRM-CID MS3를 이용한 Herceptin Disulfide-bond Peptide 분석

이전글에서 Herceptin mAb의 Disulfide-bond 펩타이드인  AEDTAVYYCSR-LSCAASGFNIK 를 분석하는 내용을 소개하였습니다.   이번에는 Orbitrap Fusion의 ETD 와 MS3 방법을 이용하여 분석해 보았습니다.

 

 

 

Orbitrap Fusion 장비는 Q-Exactive Series와는 달리 다양한 fragmentation이 가능합니다.  이러한 장점을 이용하여 HCD로 검출한 Herceptin Disulfide-bond 펩타이드 를 ETD-PRM-CID MS3를 이용하여 추가 검증해 보았습니다.  AEDTAVYYCSR-LSCAASGFNIK 의 4+에 해당하는  m/z 597.2782 를 선택했습니다. 

 

MS2 Spectra of HCD, CID, ETD 그리고 EThcD

아래는 해당 펩타이드를 Fusion Orbitrap의 HCD, CID, ETD 그리고 EThcD로 분석한 PRM MS2 스펙트럼입니다.

 

 

 

여기서 ETD와 EThcD의 경우 두 펩타이드의  backbone에 해당하는 피크가 검출됩니다. 즉 AEDTAVYYCSR (1277.5467, +1) 와 LSCAASGFNIK (1110.5612, +1)에 해당하는 피크가 MS2에서 보입니다. ETD energy에 의해서 S-S 결합이 떨어지면서 생성되었습니다. HCD와 CID에서는 검출이 되지 않는 피크입니다. ETD가 가지는 고유한 성질로 인해 두 펩타이드의 S-S 결합이 떨어져서 각각의 펩타이드가 상당히 높은 피크로 검출이 됩니다.  ETD에 의해서 S-S 결합이 떨어지면서 생성된 피크는 이론적인 m/z값보다 1Da이 적습니다.

 

이렇게 ETD를 통해 S-S로 결합된 두 펩타이드의 각각의 Precursor ion을 확인함으써 결합여부를 재확인할수 있습니다. 

 

 

MS3 Fragmentation of two peptide backbone 

MS2에서 검출되는 두 펩타이드의 Precursor ion들을 한번 더 fragmentation하여 펩타이드 sequence를 추가 검증할 수 있습니다.  m/z 597.2782 를  ETD-PRM으로 분석후 MS2에서 검출되는 AEDTAVYYCSR 와 LSCAASGFNIK 의 피크, 1276.5405(1+) 와 1109.5549(1+)를 MS3를 통해 분석하였습니다. 

 

Orbitrap의 HCD로 MS3를 분석했을시는 좋은 감도를 얻지 못했습니다.  

 

하지만 Iontrap CID 를 이용한 MS3에서 좋은 스펙트럼을 얻었습니다. MS3분석을 위해서는 감도가 더 좋은 Iontrap의 CID가 더 유리합니다. 완벽하지는 않지만 Manual Assign을 통해서 해당 펩타이드임을 확인하였습니다.

 

결론

이전의 글에서 Herceptin의 Disulfide-bond 펩타이드를  HCD를 통해 검출할수 있음을 확인하였습니다. 이렇게 검출된 펩타이드는  ETD-PRM-CID MS3 방법으로 추가로 확인이 가능합니다.

 

 

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