Herceptin, monoclonal Antibody 의 Disulfide bond 펩타이드 분석법

Biologics에 있어서 monoclonal Antibody의  intact N-linked glycopeptides 분석과 더불어 Disulfide bond peptides 분석도 상당한 중요한 분석분야입니다.

이전글] Monoclonal Antibody (mAb)에서 Intact N-linked glycopeptides 분석

 

그래서 이번에는 Herceptin mAb에서 disulfide bond 펩타이드를 분석해보았습니다.  실험을 위해서 표준단백질을 구매하였습니다. www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/msqc22?lang=en&region=US

 

Reduction 과 akylation과정없이 Lys-C 과 Trypsin를 이용하여 단백질을 절단한후 질량분석기로 측정하였습니다문헌을 통해 Herceptin 의 disulfide bond 펩타이드의 경우 상대적으로 길이가 긴 펩타이드가 만들어지는것을 확인하였습니다.

모든 단백질이 긴 펩타이드가 생성되는것은 아닙니다. Trypsin이 K, R을 절단할때 생성되는 펩타이드의 길이의 분포도는  단백질마다 다릅니다.  Herceptin의 경우 상대적으로 긴 펩타이드를 가집니다.  두 펩타이드가 disulfide bond로 연결되어 있다는 것은 K,R이 최소한 두개 이상이 있다는것입니다. Basic K,R이 많이 존재할수록 Charge state는 증가됩니다. 이러한 이유로 길이가 길고 K 혹은 R이 많이 존재하는 disulfide bond 펩타이드는 높은 charge state 를 가지게 됩니다.

 

이러한 이유로 분석시 2+,3+를 제외한 4+,5+, 6+에 해당하는 펩타이드만 fragmentation 되록 설정하였습니다. 사실 단일 단백질일 경우 이러한 방법이 크게 도움이 되지는 않습니다. 하지만 단일 단백질이 아닌  complex한 시료에서는 상대적으로 많이 존재하는 2+, 3+  펩타이드로 인해 DDA에서 상대적으로 높은 Charge state를 가지는 Disulfide bond 펩타이드가 검출이 덜 검출될 가능성이 있습니다.   좋은 방법은 일반적인 방법(2+이상이 검출)으로 분석후 Database를 통해 검출된 모든 펩타이드를 exclusion list로 설정합니다. 그리고 다시 분석하면 이전에 분석된 펩타이드는 검출이 되지 않게 됩니다. 이 경우 일반적인 database 검색방법으로 검출이 되지 않았던  Disufide bond  펩타이드가 새롭게 더 검출될수 있습니다. 

이전글]Proteome Discoverer에서 Exclusion list 만드는 방법

 

아래는 300ng을 분석하여 얻어진 크로마토그램입니다

 

 

.

Disulfide bond 펩타이는 일반적인  database 검색으로는 검출이 되지 않기 때문에 특별한 프로그램이 필요합니다.   

기존에 사용하던 Byonic과 더불어 최근에 찾아낸 pLink (http://pfind.ict.ac.cn/software/plink/)를 사용하였습니다. .

 

먼저 Byonic을 통해 아래와 같은 결과를 얻었습니다.  Heavy chain에서  몇가지 disulfide bond 펩타이드를 찾았습니다.  

 

pLink 를 이용하여 찾은 disulfide bond 펩타이드는 아래와 같습니다.  Byonic보다는 많은 펩타이드가 검출되었습니다. 하지만 pLInk 에 포함된 pLabel 프로그램을 이용하여 스펙트럼을 확인해보면 false-positive 가 많이 포함된것 같습니다.

 

 

 

검출된 펩타이드중에 상대적으로 좋은 스펙트럼을 보여주는 펩타이드(AEDTAVYYCSR-LSCAASGFNIK)입니다 

 

Validation을 위해서 pLink에서 검출된 21개의 펩타이드를 이용하여 PRM을 수행하였습니다.  

AEDTAVYYCSR-LSCAASGFNIK 에 해당하는 스펙트럼에 대해 수작업으로 확인을 하였습니다. pLink의 결과를 재확인하였습니다. 

 

 

m/z 597.0284, 4+

위와 같은 방법으로 통해서 monoclonal antibody에서 disulfide bond 펩타이드를 검출할수 있었습니다. 

요약하자면

 

1)DDA로 분석( 경우에 따라서는 2+,3+ 제외)

 

2)적절한 프로그램(여기서는 pLink)을 이용하여 database 검색

 

3)검출된 펩타이드의 정보를 이용하여 PRM 수행

 

4)PRM을 통해 얻어진 MS/MS  스펙트럼을 이용하여 수작업으로 Validation 

 

단일단백질의 경우 크게 어렵지 않게 disulfide bond 펩타이드를 분석할수 있습니다.