Acetyl 과 Trimethyl isobaric Histone peptides 분석

Histone PTM 분석에 있어서 까다로운 isobaric 중 하나는 Acety (+42.011 Da) 과 Trimethyl (+42.047 Da)그룹이 결합한 Isobaric form 입니다. 이 두개의 분자량은 약 0.03 Da 밖에 차이가 나지 않습니다. 이번에는  두 그룹이 각각 결합한  KQLATKAAR 의 isobaric form을 통해 분석해보았습니다.   

 

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Target Peptides

K[Acetyl+Propionyl]STGGK[Propionyl]APR, m/z 528.2958 (2+)

K[Trimetyl+Propionyl]STGGK[Propionyl]APR, m/z 528.3140 (2+)

 

 

Skyline Template

 

 

 

두  펩타이드의 경우 y 1에서 8까지 일치합니다. 두 펩타이드를 구분하기 위해서는 b 이온들을 확인해야 합니다.  PRM을 분석후 얻어진 Raw spectra에 대해  두 펩타이드의  3 ppm tolerance 에서  XIC를 확인하였습니다.  m/z 528.2958 은  19 분에 m/z 528.3140은 11.9  분 근처에서 검출되었습니다. 상대적인 높이는 Trimethyl 펩타이드가 약 10배정도 높습니다.

 

 

 

 

 

Skyline Results

 

수작업없이 Skyline으로 분석했을때 처음 보여지는 결과는 아래와 같습니다. 두 펩타이드가 동일한 시간대 (11.9 분)에 검출된것으로 보여집니다.  Precursor ion이 0.03 Da 차이 밖에 나지 않으며 y ion series가 서로 일치하기 때문에 Skyline은 두 펩타이드를 구분하지 못했습니다. 특별히 Acetylation form이  trimethyation form에 비해 상대적으로 낮은 abundance를 가집니다. 이로 인해 Skyline은 상대적으로 abundance가 높은 펩타이드를  우선적으로 선택하였습니다. 

 

하지만 skyline 결과에서 acetylation form 확대하면 아래와 같이  19분대에도 동일하게 일치하는 펩타이드가 나옵니다.  이것을 다시 확대하면 오른쪽 그림과 같습니다. 

 

재확인을 위해 Raw 파일을 열어서 각각의 MS/MS 스펙트럼을 확인했습니다. 각 펩타이드에서 특이적인 b1과 b2 이온을 비교해보았습니다.   Acetyl form에서  이론적인 b1, b2의 값인 227.1390, 314.1710 이 실제 분석에 227.1391, 314.1708 으로 검출되었습니다. 또한 Trimethyl form에서 이론적인 b1, b2 값인 227.17545,  314.2074이 실제 분석에서 227.1754, 314.2072 로 검출되었습니다. 즉 서로 다른 두 개의 form이 다른  retention time에서 정확히 검출되었습니다. 

 

 

 

이렇게 분자량 차이가 많이 나지 않고 많은 product ion들이 겹치게 되는 isobaric form의 경우 skyline 분석 이후 수작업으로 한번 점검을 해야 됩니다. Acetyl 과 trimethyl 그룹이 포함된 isobaric form의 경우 retention time에 에서 차이가 나므로 이점을 고려하면 됩니다.

 

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