DDA 분석에서 Peak exclusion으로 원하는 펩타이드 제외하기

.시료를 분석할때  용리되는 모든 펩타이드를 질량분석기가 분석하는것은 불가능합니다.   예를 들면 Data-dependent Acquisition (DDA)은  주어진 시간에서 용리된 펩타이드의 Full scan에서 높이가 가장 높은 펩타이드 순으로 검출합니다.  그러므로 상대적으로 펩타이드의 높이가 낮은 경우 MS/MS가 수행되지 않고 넘어갈때가 있습니다. 동일한 시료를 여러번 분석을 하더라도 검출이 되지 않는 펩타이드는 여전히 분석이 안될 가능성이 많습니다.  이때유용하게 사용할수 있는것이 peak exclusion mode 입니다. 

 

 

DDA분석에서 분석후 데이타분석을 합니다. 그리고 검출된 모든 펩타이드의 m/z와 retention time 값을 얻습니다. 이 정보를 동일한 분석방법에 추가하여 해당 peak는 검출하지 않게 합니다. 즉 다음 분석에서는 새로운 펩타이드들이 검출될 확률이 높아집니다. 물론 완벽하게 제거되지는 않지만 지량분석기가 상대적으로 새로운 펩타이드를 검출하는데 더 많은 시간을 할애하게 됩니다. 분석시 최대한 재현성 있는 LC gradient 가 요구됩니다.

 

BSA standards

 

BSA standard 펩타이드를 이용하여 exclusion하는 법을 살펴보겠습니다.

아래 크로마토그램은 100fmol BSA를 60min gradient 로 두번 분석한것입니다. LC retention time에 재현성이 있음을 확인하였습니다.

 

 

 

해당 raw 파일을 검색한 결과는 아래와 같습니다. 40개의 BSA 펩타이드가 검출되었 64% sequence coverage를 가집니다.

 

 

검출된 모든 펩타이드로 exclusion list 를 만들기 위해서 File-Export-Q-Exactive Mass List (Q-Exactive 시리즈 사용시) 를 클릭하여  파일을 생성시킵니다. 이때 검출된 모든 펩타이드를 선택하기 위해서 From Peptide Groups을 선택합니다.

Retention time Window는 좌우 2~3분 정도로 설정합니다.

 

 

얻어진 CSV 파일을 기준 Method에 첨가하여 새로운 Method를 만듭니다. 이를 위해서 기존 method를 불러옵니다. 아래와 같이 Exclusion-File에서 해당 CSV파일을 불러옵니다.

 

 

아래와 같이 해당 펩타이드가 첨부되었습니다. 

 

창을 닫으후 질량분석기의  Properties에서 Exclusin On을 선택합니다. 이렇게 되면 질량분석기는 Exclusion에 있는 펩타이드 리스트를 분석과정에서 제외시킵니다. Exclusion On을 하지 않으면 비록 리스트가 존재하더라도 실제분석에서 exlusion을 수행하지 않습니다.

 

Exclusion list가 포함된 Method로 분석합니다. 아래 그림에서 보듯이 좋은 재현성의 크로마토그램이 얻어졌습니다.

 

 

 

이 결과를 데이타검색을 하였습니다. 아래는 검색결과입니다.  기존에 약 40개의 펩타이드가 검출되었으나 이번에는 6개이 펩타이드만이 검출되었습니다. 

 

 

Herceptin mAb

 

Reduction과 akyation을 하지 않은 Herceptin mAb tryptic digest에 대한 결과는 아래와 같습니다.  exclusion list를 포함시킨 결과에는 오직 한개의 펩타이드만이 검출되었습니다.

 

Exclusion에서 검출된 한개의 펩타이드인 EVQLVESGGGLVQPGGSLR를 비교해 보겠습니다. 첫번째에서는 2+인 942.0064가 검출되었습니다. 두번째 exclusion 을 통해 분석한것은 3+인 628.3206이 검출되었습니다. 동일한 펩타이드이지만 m/z값이 다르기 때문에 두번째 분석에서 새롭게 검출이 되었습니다.  Exclusion list는 펩타이드 sequence  가 안인 오직 m/z 와 retention time만 인식합니다.

 

 

HeLa Digest

 

Complex한 시료인 HeLa digest에 대한 결과입니다. 30min gradient로 분석시 7056개의 펩타이드가 검출되었습니다.   얻어진 결과에서 exclusion list를 생성하여 Method에 삽입하였습니다. 하지만 등록할수있는 펩타이드의 수 5000개까지만 가능하다고 나옵니다. 

많은 펩타이드가 겹치는것은 아마 1) Exclusion list  수의 제한이 있는것 2)  동일한 펩타이드라도 서로 다른 전하값으로 인해 다른 m/z값이 생성되기 때문일것 같습니다.