Glu-C digested Histone 3.1 Middle-down analysis with HCD fragmentation

Histone 단백질을 분석하는 방법중 하나가 middle-down 방법입니다. Histone PTM 분석에 있어서 Bottom-up 으로 분석할때  직면하는 여러 단점을 보완할수 있습니다.  하지만 middle-down도 여러 어려움이 있습니다.

상대적으로 펩타이드의 길이가 길어짐으로 bottom-up 형식에서는 좋은 결과가 나오지 않습니다. 특히 LC separation 과 질량분석기에서의 fragmentation 에 한계가 있습니다. 이러한 이유로 C18 대신 PGC컬럼등을 대체하여 사용하며 HCD fragmentation 대신 ETD fragmentation을 주로 사용합니다.

 

 

Histone H3.1 tail 분석 

 

먼저 HCD 로 분석할때 어떤 결과가 나오는지 살펴보기로 했습니다. 이를 위해  Histone H3.1 Human, Recombinant (https://www.neb.com/, P/N M2503S) 를 사용하여 Trysin이 아닌 GluC digestion을 수행하였습니다.

 

Histone H3.1의 Sequence는 아래와 같습니다. 

>sp|P68431|H31_HUMAN Histone H3.1 OS=Homo sapiens OX=9606 GN=H3C1 PE=1 SV=2

MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALREIRRYQKSTE

LLIRKLPFQRLVREIAQDFKTDLRFQSSAVMALQEACEAYLVGLFEDTNLCAIHAKRVTI

MPKDIQLARRIRGERA

 

Glu-C  digestion 분석시 이론적으로 생성될수 있는 펩타이드는 아래와 같습니다.

여기서 N-terminal tail에 해당하는 펩타이드  MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALRE 이 생성됩니다. 분자량은 약 5.4kDa 입니다.

 

Chromatogram of Histone H3.1 Glu-C digest

아래는 GluC로 digestion한후  200ng에 해당하는 H3.1의 크로마토그램입니다.

 

 

Histone 3.1 tail Glu-C Peptide Sequence

기존의 문헌을 통해서 이 펩타이드의 경우 N-terminal의 M이 떨어진 펩타이드가 검출된다는것을 확인했습니다. 아래는 Methionine이 붙어 있을때와 떨어졌을때 이론적으로 생성되는 m/z값입니다. 

 

MARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALRE

ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGTVALRE

 

이중에 7+에 해당하는 m/z 값인 782.7871(+M)과 763.5884 (-M)에 대한 XIC입니다. 그림에서 보듯이  Methionine이 떨어진 형태가 검출되었습니다. 길이가 아주 긴 펩타이드임에도 불구하고 상대적으로 빨리 용리되었습니다.

 

 

해당영역을 확대해보면  7+, 8+, 9+. 10+, 에 해당하는 피크가 나옵니다.  이중에 10+ 피크가 가장 높습니다.

 

HCD fragmentation Engergy에 따른 MS/MS 스펙트럼

HCD fragmentation의 경우  분자량이 높고 전하가 높은 펩타이드의 경우 좋은 결과가 나오지 않습니다. 일단 +8인 m/z 668.6649에 대해서 서로 다른 NCE 값으로 측정해보았습니다. 아래는 서로 다른 NCE 값에서 얻어진 MS/MS 스펙트럼입니다. 전체적인 분포도를 보면  NCE 35와 40 에서 상대적으로 좋은 fragmentation  패턴을 보입니다.  35와 40 값으로 step NCE에 대한 결과는 제일 마지막에 보입니다.

Charge State 에 따른  HCD fragmentation 

Glu-C digested H3.1 tail 펩타이드에서 대표적으로 검출되는 7+, 8+, 9+, 10+ 에 따른 MS/MS 스펙트럼은 아래와 같습니다.  눈에 띄는 차이점은 없는것 같습니다.