Histone 의 Isobaric PTM Peptides 분석하기

histone의  modificaiton을 분석은 다른 단백질 분석과는 다르게 상당히 어렵습니다. 그 이유중 하나는 Acetylation과 Methylation이 결합하는 Lysine이 많이 분포되어 있기 때문입니다. 즉 동일한 펩타이드임에도 서로 다른 위치에 PTM이 되어 있는 Isobaric form이 많이 존재합니다. 결합한 위치는 다르지만 전체 m/z값은 동일하며 retention time의 경우도 동일하거나 거의 유사합니다.  또한 MS/MS 의 product ion들도 겹치게 되어 일단 기존의 방법으로  명확한 분석이 어렵습니다.

 

Human Histone 시료를 통해 설명해보겠습니다. 대표적인 Isobaric PTM 펩타이드인 H3의  KQLATKAAR를 예를 들어보겠습니다. Propionylation을 통해서 N-terminal과 lysine에 Propinoylation [ +56.026215]이 되어있습니다. 아래는 테이블은 대표적인 Isobaric 펩타이드입니다. 

Propionylation에 대해서는 이전글에  자세한 설명이 있습니다.

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Propionylation 된 KQLATKAAR의 Isobaric forms

PRM분석을 위해서 아래와 같이 Skyline Method를 만들었습니다.

 

Human 시료에서 추출된 Histone을 이용하여 PRM울 수행하였습니다.  아래는 Base-peak chromatogram 입니다.

 

 

여러 isoform중에 두개를 선택하여 자세한 분석을 해보았습니다.  아래 크로마토그램은 K[2xPropionyl]QLATK[Acetyl]AAR 와 K[Acetyl+Propionyl]QLATK[Propionyl]AAR 펩타이드에 해당하는 m/z 570.8404에 해당하는 XIC 입니다.  Monoisotopic peak가 0.35 ppm 의 정확도를 보입니다. Isobaric form이기 때문에 동일한 시간에 용리되었습니다.

 

Skyline에서 얻어진 두 펩타이드의 Product ion 리스트는 아래와 같습니다. 두 펩타이드중 y1, y2, y3는 겹치게 되고  나머지는 서로 다른 m/z값을 가집니다. 분석을 위해서는 y1, y2, y3  product ion을 제외하고 분석해야 됩니다.

 

 

 Skyline에서 원하지 않는 product ion 을 정량분석에서 제외시키고 싶으면 해당 Product ion에서 오른쪽 마우스를 클릭하여 "Qualitative" 에서 체크된것을 해제 하면됩니다. 색깔이 회색으로 변화게 됩니다.

 

 

Skyline을 통해 분석된 결과는 아래와 같습니다. 각 펩타이드에 특이적인  Product ion들만을 이용하여 분석되었습니다. 자세히 보면 두 펩타이드의 retention time이 미묘한 차이를 보입니다. 약 1/10초 차이가 납니다. 오른쪽 그림에서 보면 점선으로 된 피크들이 보입니다(화살표). 이것은 두개의 펩타이드에서 공통적으로 생성되는 y1, y2,y3 피크입니다. 즉 약간 늦게 용리되는 펩타이드의 y1, y2, y3에 해당됩니다.

 

 

Skyline에서 분석한 결과를 실제 raw 파일을 이용하여 검정해보는 과정이 필요합니다.  아래 raw 파일에서 보여지는 MS/MS 스펙트럼입니다. 두 펩타이드에서 생성된 product ion 들이 혼합되것을 확인 할수 있습니다. 대표적인 몇개의 product ion들을 표시했습니다.

 

 

 

Raw spectra에서 두 펩타이드의 y1 이온에 해당하는 펩타이드의 XIC입니다.  Skyline 결과도 동일하게 Retention time에 아주 약간의 차이가 있습니다.  

 

이렇게 두개의 isoform 펩타이드를 분석해보았습니다.  

 

Data-dependent acquisition (DDA)을 통해 분석하여 database 검색을 하게 되면 두 펩타이드를 명확하게 구분하지 못할수도 있습니다. 특히 두 펩타이드의 product ions이 여러개가 겹칠 경우가 그렇습니다. 이와 같은 경우는 PRM 분석과 수작업을 통해 재확인하는 과정이 반드시 필요합니다. 

 

 

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