Histone Propinolylation을 통한 bottom-up proteomic analysis

Histone 단백질, 특히 N말단 꼬리에 있는 부분은 phosphorylation,  methylation and acetylation 등 여러 PTM이 존재합니다.. 이러한 PTM은 다중적으로 일어나지만 특정한 아미노산에 국한해서 일어나는 경우가 많습니다.  또한 이러한 다양한 변화는 세포내 다양한 기능과 질병에 관련이 있습니다. Histone 는 기존 단백질과는 다른 특별한 성질을 가지고 있습니다.histone 은 상대적으로 분자량이 적으며  trypsin의 절단부분인 lysine이 아주 많이 존재합니다.  가장 널리사용되는 trypsin을 사용하게 되면 매우 작은 펩타이드 조각이 생성됩니다.   작은 조각의 펩타이드는 nano LC 와 ESI  mass spectrometry를 이용한 bottom-up 분석에  적합하지  않습니다.   Trypsin이 아닌 다른   enzyme을 사용할 경우  trypsin과는 반대로 아주 길이가 긴 펩타이드가 생성이 되어 middle-down  proteomics  법을 사용해야 합니다.   또한 trypsin  만큼 효율적이지 않는 단점이 있습니다.

 

이러한 단점을 해결하고자   펩타이드의 N-terminal과 lysine에  propionylation 을 시키는 방법이 사용되고 있습니다.    Propionic anhydride 시약을 사용하여 간단히 Lysine 과 N-terminal에  proionylation 을 시킵니다.  Lysine 이 propionylation이 되면 trypsin이 lysine을 절단하지 못하게 되어  결국 Arginine 의 C-terminal 부분만  절단하게 됩니다. 이것은 펩타이드가 아주 짧은 길이로 절단되는것을 막을 수 있습니다. 또한 N-terminal이  propionylation이 되면 hydrophobicity가 증가하게 되며 C18 컬럼에서 더 잘 결합하게 됩니다.  간단하게 설명하자면 먼저 단백질상태에서 모든 lysine을 propionylation 시킵니다. 그리고 trypsin digesiton 후 펩타이드 상태에서 N-terminal 부분을 propionylation을 시킵니다.

 

 

 

 

Histone 분석에 있어서 중요한 단계중 하나는 Histone 을 순수하게 분리하는 것입니다. 아래는 대표적인 논문입니다. 

Identification and Quantification of Histone PTMs Using High-Resolution Mass Spectrometry, Karch et al, 2015

pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27423855/

Histone이 아주 잘 분리되었는지 확인하기 위해서 소량을 SDS-PAGE로 확인합니다.  아래 이미지는 대표적인 Histone 에 대한 이미지입니다. 

 

www.epigentek.com

 

아래  Mouse에서 추출한 Histone을 Propionylation 시킨후 얻어진 스펙트럼입니다.  여느 다른 단백질의 스펙트럼과 특별히 차이는 없습니다. 

 

 

 

DDA로 분석한 raw 파일을 Proteome Discoverer 2.4로 검색을 해보았습니다. 검색조건은 아래와 같습니다.  Lysine에 Acetylation과 mono, di-,tri-methylation, propionylation,  Serine, threonine 에  phosphorylation,  N-terminal 에 Propionylation을 적용하였습니다. 

 

 

 검색결과는 아래와 같은 많은 histone이 높은 sequence coverage로  검출되었습니다.

 

검출된 펩타이드의 경우 모든 펩타이드들이 Propionylation되어 있음을 알수 있습니다. 

 

 

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