PRM / DIA 정량분석법의 최적화를 위한 peak point 찾기

PRM 혹은  DIA 분석에 있어서 최적화된 방법을 찾기는 쉽지 않습니다.  PRM경우 보통 만들어진 하나의  Parameter로  분석하고자하는 target 펩타이드 전체를 분석합니다. MRM처럼 각 펩타이드의 product ion별로 Collision energy값을 최적화 하지 않습니다. 그러므로 다양한 target 펩타이드 분석이 요구되는 PRM 이나  모든 펩타이드를 다 검출해야 하는 DIA경우 특정 펩타이드에 국한해서 최적화 할 수 없습니다. 

 

하지만 좋은 정량분석을 위해서는 기본적으로 요구되는 요소들이 있습니다.  이 중에서 펩타이드의 정량을 위한 peak point의 수입니다.  펩타이드의 정량을 위해서 각 피크가 몇번의  Detection되어 피크가 그려지고 넓이가 계산되느냐 입니다.  PRM 과 DIA 를 이용한 정량분석에 있어서 많은 수의 펩타이드를 검출하는것도 중요하지만 정량값에 신뢰성을 가지는것이 더 중요합니다

 

펩타이드의 정량값은 검출된 피크의  면적값으로 정해집니다.  즉 특정 순간에 검출된 펩타이드의 피크의 높이가 아니라 LC에서 일정 시간동안 용리되는 과정에서 생기는 피크의 면적값을 계산합니다.  펩타이드가 컬럼에서 나오는 모든 시간동안 질량분석기가 계속 검출을 하면 좋겠지만 이것은 불가능합니다. 이온을 모으는 시간이 필요하고 또한 다른 펩타이드도 검출해야 됩니다.  이러한 이유로 펩타이드의 피크는 간격이 없는 직선으로 면적이 그려지는것이 아니라  듬성듬성 찍힌 점을 이어서 그린 면적이 됩니다.  이상적인 정량분석은 모든 펩타이드가 촘촘히 찍인 점들로 면적이 그려지는것입니다. 이를 위해서는 질량분석기가 매우 빠른 속도로 각 펩타이드를 계속 검출하되  각 펩타이드마다 충분한 시간동안 검출해야 합니다. 속도와 감도가 모두 최상이어야 합니다. 하지만 아쉽게도 이 두 개는 서로 반대성향을 가집니다. 빠른 속도를 위해서는 감도를 희생해야 하며 높은 감도를 위해서는 속도를 늦추어야 합니다. 이 두 개의 조건에 따라 피크면적이 달라질수 있으며 결국 정량값에 영향을 줍니다.

 

Peak Area vs Peak points

아래 그림에서 보듯이 검정색 피크는 선으로 연결되어 완벽한 피크면적을 계산할수 있습니다.  그 다음 그 밑에 노란색 점선의 피크와 같이 아주 촘촘한 점선으로 그려지면 이론적인 피크면적과 거의 동일하게 됩니다.  하지만 오른쪽 파란색,하늘색, 초록색 의 피크에서 보듯이  검출된 포인트가 줄어들수록  혹은 어느위치에서 포인트가 생기느냐에 따라 피크의 모양이 이론적인 모양에서 멀어집니다. 결국 정량값이 달라지게 됩니다.

 

포인트가 적으면 재현성에도 문제가 생깁니다.  아래 그림과 같이 A처럼 촘촘히 검출되는 경우 정상적인 피크모양이 나옵니다. B 와 C를 비교해보면 동일한 간격으로 피크가 검출되었지만 위치에 따라 피크모양이 달라집니다.  듬섬등성 포인트가 형성되는 경우 B 와 C 처럼 재현성이 떨어지게 됩니다. 동일한 시료를 분석했음에도 정량값이 달리지게 되는것입니다.

 

LC Peak resolution vs Peak points

또 하나 중요한 요소는 LC의 크로마토그램의 피크 모양입니다. 동일한 질량분석기의 속도와 감도를 사용할때 LC 피크의 모양에 에 따라서 포인트의 수가 달라집니다.  아래 그림에서와  같이 피크의 모양이 더 좁을 수록 포인트의 수가 줄어듭니다. 

 

 

그러면 보통 몇개의 포인트로 피크가 그려지는것이 좋을까요?   대략 최소 8~10개 정도의 포인트가 요구됩니다.  물론 많으면 많을수록 좋지만  그 이상이 되더라도 큰 차이는 없게 됩니다. 

 

 우리는 최적화된 방법을 찾기 위해서 여러 논문을 보고 비교합니다. 하지만 막상 본인 실험에 적용하면 그것이 자신의 시스템에 최적화된 것인지 의문이 듭니다. 최소한 분석방법이 괜찮다는 확신이 필요할 때가 있습니다.  이럴때 대락 위와 같은 점을 고려해서 자신이 만든 방법이 나쁘지 않다는 확실을 가질수 있습니다.  해당 LC에서의 피크의 분해능을 고려한후 각 펩타이드당 대략 8~10개의 포인트가 생성되록 조건을 잡아야 합니다.  하지만 사실 이러한 작업은 쉽지 않습니다. 보통 실험실에서는 기존에 사용하던 좋은 Method를 하나 만들어서 쓰는경우가 많습니다.  비록 질량분석기의 파라미터를 최적화 하더라도 분석결과가 엄청 좋아지는것도 아닙니다.  하지만 대략의 가이드라인은 가지고 있으면 최소한 잘못된 방법에 의한 실험의 오류를 방지할수 있습니다. 

 

 

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