DIA Spectra library 를 위한 Spin-column 형태의 hpRP, SCX, and HILIC 기반 펩타이드 분획

DIA 분석을 위해서 HPLC 장비를 이용하여 대량으로 시료를 분획하여 DDA로 Spectra를 생성합니다. 하지만 가끔씩 HPLC 장비의 이용이 불가능할 때가 있습니다.  이럴때 서로 다른 Chemistry를 갖는 여러개의 Spin-column 을 이용하여 쉽게 분획 할 수 있습니다.

 

작년에 자궁경관(human Cervix)에 대한 정량분석 요청이 있습니다. 약 150개의 시료에 대해 DIA를  수행해야했습니다. 

HPLC 장비를 이용하여 분획을 하기도 하지만 HPLC 장비를 사용하는것이 번거로울때도 있습니다.

 

Spectra library를 위해 hpRP, SCX, HILIC spin-column을  사용하였습니다. hPRP, HILIC spin-column은 이전 글에 설명이 되어 있습니다.

 

BioPureSPN HILIC (ERLIC) Spin-column의 용량및 성능검증

 

C18 Spin-Column 으로 High pH Reverse-Phase chromatography Fractionation 하는 법

 

SCX는 Havardapparatus 제품을 사용하였습니다.

https://www.harvardapparatus.com/cation-exchange-chromatography-spincolumns.html

 

 

 

 

일반적으로 liver 같은 tissue의 경우 분획하지 않은 시료의 경우에도 2시간 LC gradient의 경우 3,000 이상의 단백질을 검출할수 있습니다. 하지만 이 시료의 경우 정도 1300개 밖에 검출이 되지 않았습니다. 시료에 따라  전체 단백질중에서 소수의 단백질이 상당한 양을 차지 할 경우 다른 단백질이 잘 검출되지 않는 경향이 있습니다.

 

 

아래는 3가지의 chemistry(C18-hPRC, HILIC, SCX) 로 분획하여 얻어진 단백질과 펩타이드 수에 대한 벤다이어 그램입니다.

 

 

 

각각의 분획법에서 얻어진 단백질의 수는 유사합니다. 하지만 각 분획에서만  검출되는 단백질 및 펩타이드가 존재합니다. 그래서 모두를 합치면 전체 단백질 및 펩타이드 수는 많이 증가하게 됩니다.

 

아래는 3가지의 분획에서 얻어진 수의 합과  분획하지 않은 시료를 두번 주입하여 얻은 수를 비교한것입니다.

그래프에서 보듯이 분획후에 단백질 과 펩타이드의 수가 

 

 

당연한것이지만 분획하지 않고 2번 반복주입하여 얻은 수에 비해서 단백질과 펩타이드의 수가 각각 4배, 7개 정도증가하였습니다.  HPLC 장비로 분획하기가 어려운 상황이면 이렇게 여러가지 spin-column 을 이용하여 분획하면 좋을듯합니다. 단 분획수가 많아짐으로 LC-MS/MS 분석시간도 증가됩니다. 주말에 분석을 해놓으면 월요일에 모든 결과가 나오겠네요.

 

 

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