C18 Spin-Column 으로 High pH Reverse-Phase chromatography Fractionation 하는 법

Harvard Apparatus 의 Micro C18 Spin-column 를 이용한 펩타이드 분획방법이다.  요즘 많이 사용하고 있는 high pH reverse-phase chromatography (hpRP) 를 이용한 방법으로써 알카리성의 buffer와 Acetonitrile의 혼합액으로 펩타이드를 분획방법이다.  Hydrophobic C18은 성격 그대로  펩타이드들과 hydrophobic interaction을 통해 분리한다. 일반적인 C18 컬럼에서 펩타이드를 분리하고자 할 때는  산성조건 (pH < 3)에서 이루어진다. 이 산성 조건에서는 펩타이드들이 Protonation이 되어 hydrophobicity가 증가하게 된다. 이것은  펩타이드들이 C18과 다른 상호작용인 아닌 오로지 Hydrophobic interaction만으로 분리되기 때문에  분리능을 향상 시킨다.

 

그러나 알칼리성 조건에서는 (pH > 8)에서는 펩타이드의 pKa값에 따라 전하를 띄게 된다. 즉 알칼리성 조건에서는  산성조건에서와는 다르게 hydrophobic  interaction외에도 펩타이드의 전하에 따른 추가적인 상호작용이 존재한다. 그러므로 동일한  펩타이드라도 산성과 알카리성 조건에서 분리되는 경향이 다르게 나타난다. 이러한 성질을 이용하여  알라키성 조건에서 펩타이드를 분획한후 다시 산성조건에서 LC-MS/MS 분석을 수행한다.

 

분석의뢰 서비스에서 펩타이들 분획해야 되는 경우는 보통 아래와 같다

1) Tandem Mass Tag 나 SILAC으로 처리된 시료의 경우 검출되는 단백질의 수를 증가시키기 위해

2) Data independent Acquisition (DIA) 실험시 Data dependent Acquisition (DDA)를 이용하여 Spectra library 생성하기 위해

3) 고농도의 단백질에서 극미량의 표적 단백질/펩타이드를 검출을 위해 

 

High pH Reverse-Phase chromatography Fractionation 

보통 100 µg 정도면 Downstream의 질량분석에 적합하다. 시료양에 제한이 없다면 micro C18 spin-column은 300 µg까지도 가능한다.

 

소량의 시료의 분획에 관한 방법은 논문으로 나온바 있다. (Lee et. al, JPR, 2016)

 

 

ABC: Ammonium Bicarbonate, TEAB: Triethylammonium bicarbonate

모든 분획은 microcentrifuge에서 300 x g 의 회전속도로 약 1~2분간 수행한다.

 

1) 100 µl 100 % ACN으로 컬럼 세척한다.

2) 200 µl 0.1 % TFA로 컬럼 활성화한다.

3) 100 µg 시료를 100~200 µl의  0.1% TFA 에 녹인후 컬럼에 로딩. 알칼리 용액으로 시작해도 된다.. 하지만 산성조건에서 시료 loading시 보다 C18과의 결합력에 더 도움을 줄것이다. 사전에  Clean-up 된 시료를 사용해도 되지만 이 과정에서는 clean-up되지 않은 시료를 사용해도 상관없다. 어짜피 시료  Loading 및 washing 과정자체가 clean-up 과정이 포함되어 있다.

4)  200 µl 0.1% Formic Acid로 세척한다.

5)  100 µl 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 70% ACN in 100mM ABC 로 각 각 용리시킨다 ( 40% step는 빼도 됨, ABC 대신 TEAB 사용가능).

6) 각 용리액은 건조시킨후 0.1% TFA로 녹인후 질량분석에 주입한다.   (보통 1/3 정도의 양이면 충분함)

 

 

 

아래 크로마토그램은 100  µg의 mouse liver tissue 펩타이드를 위의 방법으로 수행한 결과이다. 

 

hPRP로 분획시 hydrophobic interaction 작용이 포함되므로 펩타이드는 위에 보듯이 분획되는 순서에 따라 펩타이드의 용리 패턴이 다르다 ( 뒤로 갈수록 펩타이드의 용리시간도 전반적으로 길어진다).  일반적으로 하나의 LC-MS/MS 조건으로 모든 분획을 분석하는데  2~3가지의 서로 다른 LC gradient를 각 분획에 적용시키면 보다 더 넓게 퍼지는 크로마토그램을 얻을수 있을 것이다.  즉 5, 10, 15% 분획은 완만한 기울기의 LC gradient, 20, 25% 분획은 약간 더 급한 기울기, 30,40, 70%는 보다 더 급한 기울기(혹은 초기 LC 조건을 높은 ACN %로 시작) 사용하는것이다.

 

 

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