C18 Reverse Phase Chromatography SpinColumns (Harvard Apparatus)을 이용한 펩타이드 전처리

Trypsin digestion의 양에 따라 적절한 용량의 C18 컬럼을 선택해야 된다. 그렇지 불필요한 시료의 손실이 발생한다.

 

분석시료의 양에 따라 Harvard Apparatus 사에서 판매되는 Ultra, micro, Macro C18 Spin-column을 사용한다.

(10 µg이하의 시료에는 3M 사의 C18 Disk 를 이용해서 충진해서 사용한다. 관련 블로그 보기)

 

회사에서 제공하는 컬럼 사이즈에 따른 시료 용량은 아래와 같다.

 

컬럼별 시료 용량 확인

컬럼별로 대략의 시료용량을 확인해 보았다.

아래와 같이 Ultra- 사이즈에는 30 µg (HeLa digest), Micro-사이즈에는 60 µg 과 100 µg(HeLa digest), Macro-사이즈에는 500 µg 과 1000 µg (Mouse tissue)을 로딩하였다. 이전의 경험에 의하면 적정용량보다 더 많은 양을 로딩해도 괜찮았기 때문에 이번 테스트에도 약간 과량의 양으로 테스트했다

 

 

 

Loading/ Washing(0.1% F.A) 와 Elution (70% ACN) 에서 받은 용리액을 각각 질량분석기로  분석하였다. Loading/Washing 용리액은 전체의 50% 를 주입하였고, Elution에서 받은 용매는 각각 2 µg의 양이 주입되도록 하였다.

 

• Ultra C18 Spin-column

    Loading: 30 µg of HeLa digest

30 µg of HeLa digest

• Micro C18 Spin-column

    Loading: 60 µg (위) and 100 µg (아래) of HeLa digest

 

60 µg of HeLa digest

 

 

100 µg of HeLa digest

 

• Ultra C18 Spin-column

         Loading: 500 µg (위) and 1000 µg (아래) of Mouse liver

 

500 µg of Mouse liver

 

1000 µg of Mouse liver

결론

 

모든 실험에서 Flow-through에서는 펩타이드 피크가 거의 검출되지 않았으며 Elution에서는 정상적으로 검출되었다.

이것은 ultra 사이즈의 경우  최소 30 µg, micro 사이즈의 경우 100 µg, Macro 사이즈의 경우 최소 1000 µg 까지 로딩이 가능할 것으로 보인다.