GL-Tip GC (Carbon Spin-column) / Pierce™ Graphite Spin Columns 을 이용한 펩타이드 정제방법

GL Science 사의 Carbon spin-spin column과  Pierce 사의 Graphite Spin column을 이용하여 펩타이드를 정제하고 분획하는 방법을 적고자 한다. 

 

Figure 1. Image of the Carbon Spin-column

Carbon Spin-column (GL Science, P/N 7820-11201 )

일반적으로 펩타이드 정제를 위해서는  C18 material이 가장 널리 사용되고 있다.  또한 C18으로 충진된 stage-tip column은 high pH Reversed-Phase (hPRP) fractionation 방법을 이용해 소량의 펩타이드를 분획하는데 사용되고 있다.

 

C18과 다른 chemistry를 가지는 Carbon 충진 column은  사용빈도가 상대적으로 낮지만  Hydrophilic 펩타이드의 정제에 유용하게 사용되고 있다.   즉 C18에 결합할 만한 충분한 hydrophobicity를 가지지 않은 펩타이드 정제에 유용한다.  보통 분석서비스에서는 잘 사용하지 않으나 phosphopeptide enrichment 후 정제를 위해 구입해서 사용하고 있다.

 

이 컬럼의 특성에 대해 조금 더 알고자 몇가지 실험을 해보았다. 

아래 그림은  C18 과 Carbon stage-tip을 이용하여 HeLa digest를 clean-up한 크로마토그램이다. 그림에 보듯이 전반적으로 유사한 패턴을 보였다. 아마 대부분의 펩타이드는 두 컬럼에서 동일한 양상을 보이는것 같다.

 

1) Peptide clean-up with C18 and Carbon columns

 

Figure 2. Chromatograms of Hela cleaned with C18 and Carbon column

이중에서 상대적으로 hydrophilic 한것과  hydrophobic 한 펩타이드를 골라서 두개의 컬럼에서의 양상을 비교하였다.

아래 그림은 두 펩타이드에 대한 XIC이다.  XIC에서 보듯이 상대적으로 hydrophilic 펩타이드는 C18컬럼에서 검출이 되지 않았으나 Carbon 컬럼에서는 검출이 되었다. 반대로 hydrophobic한 펩타이드는 C18컬럼에서만 검출되었다.

hydrophilic한 컬럼은 아마도 loading단계에셔 C18 컬럼에 충분히 결합이 되지 않은것 같다.  Hydrophobic 펩타이드의 경우 정확한 이유는 알수 없으나 Carbon 컬럼에 아주 강하게 결합하며 용리되지 못한것 같다. 그러나 두번의 반복실험만으로는 결론을 낼수는 없으며 아마 추가적인 검증이 필요할것같다. 

 

Figure 2.  Extraction Ion chromatogram of hydrophilic and hydrophobic peptides cleaned with C18 and Carbon column  

 

2) Peptide fractionation with a Carbon column

 

이 컬럼을 이용해서 hpRP와 같이 펩타이드를 분획하였다.  hpRP에서 사용하는 high pH buffer가 아닌 간단히 유기용매의 %에 따라 분획을 하는것이다. Carbon과 펩타이드의 상호작용은  C18과 다르게 순수한 hydrophobic interaction이 아니다.  그러므로 유기용매의 증가에 따라 분획후 각 분획을  C18 analytical column으로 분석하게 되더라도 큰 문제는 없을것이다 

 

아래 그림과 같이 Carbon spin-column을 30 µg을  10~100 % ACN in 0.1% TFA 로 10개 분획을 하였다(Figure 2). 각 분획은 LTQ로 분석하였다(Chromatogram 확인용). 

 

Figure 3. Peptide fractionation with a carbon spin-column (30 µg HeLa digest)

아래 그림은 10개의 분획을 LTQ로 분석한 크로마토그램이다.  hpRP 분획과 약간 유사한 패턴을 보인다. 즉 elution순서가 증가할수록 chromatogram은 오른쪽으로 치우치는 경향이 있었다. 

 

Figure 4.  Chromatograms of the elution fractionated from a carbon spin-column

크로마토그램에서 보듯이 펩타이드들은 적절하게 분획이 된것같다.   단 60% ACN 이상의 분획은 유사한 패턴을 보였다. 그러므로 60% 이상은 하나의 분획으로 진행해도 될것같다 (총 6개 분획).  본 실험을 통해서 본 Carbon spin-column으로 소량의 시료를 분획하는데도 사용할수 있음을 확인했다

 

3) Peptide fractionation with larger carbon column (Pierce™ Graphite Spin Columns, 88302)

GL science의 carbon spin-column은 약 30 µg이내의 시료분획에 적합하다. 하지만 시료가 충분히 많은 경우 loading양을 증가시키면 차후 질량분석시  단백질 검출수를 증가시킬수 있을것이다. 

 

찾아보니 조금 더 큰 용량의 carban 컬럼이 있었다.  Pierce™ Graphite Spin Columns, 88302 (바로가기)

 

                                                      

   

100 µg  HeLa digest를 이용하여 GL science의 컬럼과 동일한 elution 조성으로 분획하였다. 아래 그림은 10개 분획에서 얻어진 chromatogram이다.  GL Science의 carbon 컬럼과는 약간 다른 패턴을 보이지만 전반적으로 유사한 결과를 얻었다.  

 

시료의 양이 충분하다면  사이즈가 큰 컬럼을 사용하여 분획해도 될것이다. 분획된 양이 충분함으로 남은 시료는 재차 분석하거나 다른 용도로 사용할수 있다.  그리고 Carbon 컬럼의 elution buffer에는 salt가 들어가지 않음으로 분획후 추가적인 clean-up 단계없이 농축후 바로 분석이 가능하다는 잇점도 있다.