10-Plex TMT 에 100 µg이상의 단백질 Labeling 하기 (400 µg까지 확인)

TMT 시약은 는 아마 가장 널리 사용되는 정량분석방법중 하나일것이다.  분석의뢰의 경우에도 10개 이하의 시료의 정량분석은 대부분 TMT 시약을 이용한 분석서비스를 제공하여 왔다.

 

Manufacture 프로토콜에 의하면 각 reagent당 최대 100 µg의 단백질까지 Labeling 가능하다.

하지만 많은 논문들에서 100 µg 이상의 양을 사용한것을 볼 수 있다.  각 시료당 100 µg의 양이면 일반적인 단백질 정량분석에는 충분하다. 하지만 Enrichment가 필요한 PTM 분석은 일반 단백질보다 많은 양의 시료가 필요할때가 있다. 이때 시료양을 증가시킴에 따라 고가의 TMT를  추가로 사용하게 되면 분석의뢰자들에게 비용이 더 청구되기 마련이다. 그러므로 추가로 10-plex TMT를 구매할 필요없이 시료의 양을 증가시켜 사용할 수 있는지 직접 확인해 보았다.

 

1) Labeling of 100 µg, 200 µg,  and 400 µg with 10-plex TMT

10-plex TMT 분석서비스시 의뢰자의 분석 시료 수가 정확히 10개가 아닐 경우가 종종 있다. 이때 남은 reagent가 생긴다.  이 reagent를 이용하여 실험하였고 아래는 간단한 실험을 위한 Workflow이다 (Figure 1.  100, 200, 400 µg HeLa digest를 각각  130N, 130C, 131로 Labeling한후 분석하였다

 

 

Figure1. The workflow of TMT labeling with 100, 200, 400 µg HeLa digest

Labeling efficiency를 확인하기 위해서  100 µg이상에서 labeling 되지 않은 펩타이드가 존재하는지와 3개의 reporter ion들이 이론적인 ratio (1:2:4)로 측정를 측정하였다. 이를 위해서 PD 검색시 TMT option 없이 검색을 하였다. 만약 labeling이 되지 않는 펩타이드가 있을 경우 이 검색을 통해 확인될것이다. 하지만 결과는  이러한 펩타이드가 거의 없었다. 또한 검색이 된 펩다이들도 실제로 labeling이 된 펩타이드였으나 전체적인 signal이 매우 낮아서 우연히 검색된것들이다.  

 

다음은 실제  reporter ion의 상대적인 intensity ratio를 체크하였는데 거의 이론적인 ratio 비율로 측정되었다. 아래는 Reporter ion intensity의 한 예이다(Figure 2).

 

Figure 2.  The intensity ratio of reporter ions of 130N, 130C, 131

 

PD 검색을 통해 정량값이 어떻게 나오는지 확인하였다. 아래 표에서 보듯이 normalization을 하기 전의 값은 이론상의 값인 1:2:4에 거의 근접하였다 (왼쪽). 즉 펩타이드들에서 얻어진 reporter ion intensity 값을 단백질 정량값으로 변환된 값도 이론적인 값에 근접한것이다. 

 

Table 1.  The abundance ratio of 130N, 130C, 131 with no-normalization and normalization

 

 

놀라운것은 normalization을 수행한 값은 거의 1:1:1 값으로 측정되었다 (오른쪽). Proteomie Discoverer 가 technical error에서 발생되는 오차(여기서는 임의적으로 조정)를 잘 조정한다는것을 다시 한번 알게 되었다. 

 

2) Reproducibility of  400 µg labeling of  10-plex TMT

400 µg가 재현성 있게 labeling이 되는지 확인하기 위해서 두  400 µg  재현성을 확인해 보았다 (Figure 3 ).

 

 

Figure3. The workflow of TMT labeling with two  400 µg HeLa digest

아래의 그림과 같이 대부분 126 과 131 에 해당하는 reporter ion이 1:1의 비율로  나왔으며 Proteome discoverer 에서 

normalization을 하지 않은 값을 이용한 그래프에서도 좋은 결과가 나왔다.

Figure 4. Reproducibility of  TMT labeling with two 400 µg digest

동일한 양의 TMT reagent를 사용하여 기존의 100 µg 보다  더 많은 양을 정상적으로 labeling 할수있다는 것은 가격적인 면에서 또한 downstream을 분석을 위해서도 여러 장점이 있다. 가장 보편적인 PTM 분석서비스중 하나인 gloabl phosphorylation analysis에서는  최대한 많은 양으로 확보하는것이 중요하다.  검출되는 펩타이드의 수도 증가될뿐 아니라 재현성있는 정량분석값을 얻을수 있기 때문이다. 또한 TiO2를 이용한 phosphopeptides enrichment에서 아주 가끔씩 발생하는 실패를 대비하여 추가분석을 위한 시료도 여유있게 확보할수 있기 때문이다.

 

TMT 분석에 있어서 분석의뢰자가 시료의 양을 확보하는데 제한이 없다면 일단은 최대한 많은양 (~1mg)을 요청한다.

 

 

 

 

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