TMT 정량의 분석에서의 SPS MS3 방법은 진짜 좋은가?

TMT 실험에서 서로 다른 펩타이들의 co-fragmentation은  정량성을 떨어뜨리는 주요 원인중 하나입니다.  이로인해 실제 단백질의 양이 변화된 값과 TMT로 측정된 정량값이 상당히 차이가 날수 있습니다.  TMT를 이용하여 실험을 해본 분들을 알겠지만 결과가 매우 재현성 있게 나옵니다.  이것은 실험이 잘되었다기 보다는 cofragmentation에 의해 정량값이 평준화되었기 때문일 경우가 많습니다.  Label-free 방법과 비교하면 TMT 정량분석에서 3배 이상 차이나는 단백질의 수가 그다지 많지 않습니다.

 

이러한 이유로 여러 논문에서   Multi-notch (SPS) MS3 방법이 널리 사용되고 있습니다 (e.g.,  McAlister et.al., Anal.Chem 2014, 86(14), 7150).  사실 저는  cofragmentation의 문제를 크게 신경쓰지 않았습니다.  논문에 나온것과는 다르게 실제 실험에서는 기존방법 (MS2) 에 비해 월등히 나은점을 발견하지 못했기 때문입니다.  검출되는 단백질의 수도 현저히 적었습니다.   논문의 경우 SPS MS3 의 장점을 부각시키기 위해  특별히 최적화된 실험 디자인을 사용했으리라 생각합니다.  그래서  일반 실험실에서는 효과가 많이 없을것이라 생각합니다.   사실 MS3방법에서 5배가 차이나는것이 MS2에서는 3배 정도 차이가 나더라도 결과를 도출하는데 큰 문제가 없을 때도 있습니다. 또한 MS2 방법에서  isolation window를 0.5  혹은 0.7 mz로 사용하여 cofragmentation의 영향을 최대한 줄이고 있습니다.

 

 

하지만 최근에 분석의뢰자로 부터 아주 납득할만 불평을 들었습니다.  Western-blot에서  30배이상 차이나는 단백질이 TMT 분석에서는 3배 이상밖에 차이를 보이지 않았습니다. 아래는 Western-blot에서 30배 차이가 난 단백질의 펩타이들의 정량값 분포도입니다.  테이블에서 보는것과 같이 특정 펩타이드는 16배, 10배 이상 증가되었으나 나머지는 3배 이하로 증가함을 보입니다. 이 값들이 단백질 정량값으로 변환되면서 결국 3배정도  증가로 나타났습니다.  펩타이드의 Intensity등에 따라 cofragmentation 영향을 많이 받는것과 덜 받는것이 존재하는 것 같습니다. 이런 경향이면 TMT를 이용한 정량분석값에 대한 신뢰성에 의심을 갖게 됩니다. 

 

TMT정량분석에 있어서 MS2 와 SPS MS3 분석 비교

차후 분석서비스를 위해서 다시 한번 SPS MS3 방법을 테스트해 보았습니다.  이를 위해 3개의 100 µg  HeLa digestion 에 25 ng, 500 ng, 1000 ng Ovalbumin (1:10:20 비율)을  각각 혼합한 후  10-plex TMT kit의  128C, 130N, 131과 반응시켰습니다.   반응후 합쳐진 시료는 아래의 그림과 같이 Orbitrap Fusion를 이용하여  MS2 와  MS3 방법으로 각각 분석하였습니다.  분획없이 진행하였습니다. 3번 반복하여 얻어진 파일은 Proteome discoverer 2.4로 분석하였습니다.

 

 

Orbitrap Fusion에서 사용한 Parameter는 아래와 같습니다.

 

아래 그래프는 3개의 시료에서 Ovalbumin의 이론적인 비율입니다

 

MS2와 SPS MS3 방법에서 검출된 단백질과 펩타이드 수 비교

아래 그래프는 MS2 와 MS3에서 검출된 단백질(왼쪽)과 펩타이드(오른쪽)의 수를  보여줍니다. 기존에 생각했던것 과는 다르게 MS3 방법에서 얻어진 수가 MS2에서 얻어진 수에 근접하였습니다.

 

 

MS2와 SPS MS3 방법에서 Ovalbumin 의 상대적인 정량값 비교

두 방법에서 측정된 Ovalbumin(이론값 1:10:20)의 상대적인  비율입니다. 아래 그래프에서 보듯이  MS2 방법에서는 이론적인 비율에 훨씬 못미치는 값을 보였지만  SPS MS3 방법에서는 이론적인 비율에 근접하는 값을 보였습니다.

각 방법에서 측정된 Ovalbumin의 펩타이들의 정량값은 아래와 같다.  각 펩타이들의 정량값에서도 SPS MS3에서 검출된 펩타이드의 수는 약간 적지만  정량값은 확실히 높은 일관성을 보입니다.

 

이번 테스트에서   SPS MS3 방법이 MS2에 비해서 정량성이 훨씬 높다는 것과 검출되는 단백질/펩타이드의 수도 크게 차이가 나지 않는다는 사실을 발견했습니다. 사실 유사한 실험은 오래전에도 했었으나 그  당시에는 SPS MS3방법에서 서 검출된 단백질/펩타이드의 수가 현저이 낮았었습니다.  최근 결과와 어떤점이 차이가 나는지 잘모르겠으나 아마 장비의 MS3의 감도의 차이가 아닌가 생각합니다. 최근에  엔지니어가 장비를 점검한후 감도가 향상되었었습니다.  아마 좋은 감도로 인해 MS3부분이 많이 향상되었을 것이라 생각합니다.

 

Label-free 분석과의 비교 

TMT와는 다르게 Cofragmentation의 영향을  받지 않는 Label-free 분석과 비교해보았다. 이를 위해 3개의 동일 양의 HeLa digestion에 Ovalbumin을 1:10:20의 비율로 첨가하여 분석하였다 (아래그림 참조)

 

 

Proteome Discoverer로 분석한 결과는 아래와 같습니다.  흥미롭게도 label-free 방법에서 이론적인 값과 상당히 근접한 값을 얻었습니다.  High resolution에서 얻어진 MS1 으로 이용한 정량값이 상당히 정확함을 알수 있었습니다.

The relative abundance of Ovalbumin in a TMT experiment

TMT를 사용한 후로는 label-free 방법은 거의 사용하지 않았습니다.  Label-free 방법에 비해 TMT 분석방법은 펩타이드를 분획할 수 있고  또한 많은 시료를 한번의 실험으로 정량분석할 수 있다는 장점이 있었기 때문입니다.

하지만 경우에 따라서는 label-free 방법도 여전히 좋은 방법임을 다시 알게 되었습니다.

 

 

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