BioPureSPN HILIC (ERLIC) Spin-column의 용량및 성능검증

Nestgroup사에서 판매하는  BioPureSPN HILIC 컬럼에 대해서 테스트해 보았습니다.  다음에 올리겠지만 HILIC 컬럼은 C18와 더불더 펩타이드의 분획에 유용하게 사용됩니다. 그래서 C18 과 HILIC 컬럼 두개를 동시에 사용하면 보다 많은 단백질/펩타이드을 검출할 수 있습니다.  

 

Vendor: The Nest group

BioPureSPN MACRO, 100mg, 120Å, "PSA" (Primary Secondary Amine) ERLIC-WAX 0.2-1mg/35-350µg capacity, 50-200µL, 100/bx

 

 

 

컬럼용량 확인 및 성능검증

새로운 컬럼을 구매하면 먼저 컬럼의 용량을 확인합니다. 회사에서 제공하는 용량은 정확하지 않습니다. 또한 특정한 조건에 테스트를 하기 때문에 각 실험실에서 사용하는 방법하에서 테스트를 해야 됩니다. 컬럼 메뉴얼에는 350µg 까지 가능하다고 적혀있지만 이것은 small molecules인지 large molecules인지 명확하지 않습니다.  

 

300µg 의 rat liver digest를 이용하여 테스트해 보았습니다.

 

• Conditioning Buffer:  0.1% TFA in H2O
• Loading / Equilibrium Buffer: 95% ACN, 3% H2O, 0.1% TFA
• Washing Buffer: 95% ACN, 3% H2O, 0.1% TFA
• Elution Buffer: 0.1% Formic Acid in H2O

1. Add 200 uL condition buffer to column  and spin for 1 min 

2. Equilibrate with 200µL with a loading buffer ( x 2)

3. Add sample and spin (collect an eluent, Tube 1)

4. Wash a column with 200µL with a wash buffer (x 2, collect an elutent, Tube1)

5. Elute samples with 200µL with an elution buffer (collect an elutent, Tube 2)

6. Dry a Flow-through (Step3 and 4) and elution solution (step 5)

7. Analyze via LC-MS/MS

 

 

Flow-through와 Elution 을 각각 분석하였습니다. 컬럼의 Capacity가 300 µg이상이 된다면   Flow-through에서는 펩타이드가 검출이 되지 않아야 되며 Elution에만 펩타이드가 정상적으로 검출되어야 합니다. 

 

 

결과는 아래와 같습니다.  스펙트럼에서 보듯이 Flow-through에서는 펩타이드가 거의 검출되지 않았습니다. 보이는 피크들은 Single charge를 갖는 contaminant 피크들입니다. 대신 Elution 에서는 펩타이들이 아주 정상적으로 검출되었습니다.  이러한 결과는 이 컬럼의 용량은 300 µg이상은 가능할것 같습니다. 보통 300µg 이상의 양을 사용하는 경우가 드물기 때문에 300µg 이하에서는 아무 문제없이 사용할 수  있으리라 생각합니다.