TMT 정량분석에서 Proteome Discoverer의 Co-isolation threshold 값의 효과

TMT 를 이용한 정량분석에서 LC에서 용리된 유사한 m/z 를 가지는 이웃 펩타이드의 co-fragmentation으로 인해 TMT 정량분석에 정확도가 떨어진다고 알려져 있습니다.  아래 관련글 참조

 

이러한 문제점을 해결하기 위해서 Orbitrap  Fusion을 이용하여  Multi-notch (SPS) MS3를 수행합니다.  하지만 Q-Exactive 시리즈와 같은 장비는 MS3가 불가능합니다.  이전글에서도 보듯이 MS2 방식에서는 얻어진 상대적인 정량값은 실제 값과 많이 차이가 납니다(아래 관련글 참조).

 

Co-isolation Threshold

Proteome Discoverer 의 검색에서 이러한 문제를 어느정도 해결할수 있는지 확인보았습니다. Reporter ions 정량분석을 위한 Consensus workflow에서 Reporter ions Quatifer에  Co-isolation Threshold가 있습니다.

 

이것은 MS2에서 특정 펩타이드를 검출하는데 사용된 피크외에 다른 피크들이 일정수준 이상으로 많을때는 정량값을 계산하는데 사용하지 않게 하는 기능입니다. 다른 펩타이드들이 혼합되어 있기 때문에 reporter ion의 높이에도 큰 영향을 주기 때문입니다.  Default 값은 50으로 되어 있습니다. 즉 해당 펩타이드를 검출하고 남은 피크들이 50% 이상일 경우 정량분석에 사용하지 않겠다는 뜻입니다.  

 

 

Default 값인 50과 더불이 더 엄격한 기준인 30 과 10을 사용하여 비교해 보았습니다. 사용한 raw 파일은 이전의 실험에서 사용한 HeLa digestion에 ovalbumin의 1:10:20으로 혼합한 시료입니다.  또한 MS2 isolation window는 1.5 m/z 과 0.7 m/z 각각 두가지를 사용한 결과입니다.

 

 

검색한 결과는 아래와 같습니다.

먼저 Co-isolation threshold와 MS2 isolation window에 따른 Ovalbumin의 상대적인 정량값입니다.  그래프에서 보듯이  Co-isolation threshold 나 MS2 isolation window 값에 따라 특별히 차이가 없습니다. 1:10:20의 이론적 차이가 남에도 불구하고 상대적인 차이는 크게 나지 않습니다. 

 

다음은 각각 조건에 따라 검출된 단백질과 펩타이드의 수입니다. Co-isolation thresold는 정량값에만 관련이 되어있고 정성값에는 영향을 주지 않습니다. 그래서 검출된 단백질과 펩타이드의 수는 조건별로 동일합니다.

 

결론적으로 이 데이타에 한해서는 co-isolation threshold가  정량분석에 큰 도움이 안되는것 같습니다. 하지만 검출되는 단백질 및 펩타이드수에 큰 변화가 없다면 co-isolation threshold를 약간 낮추어서 검색하면 도움이 되지 않을까 생각합니다.

 

 

 

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