DSSO (disuccinimidyl sulfoxide) Crosslinking (XL-MS) 펩타이드 분석 (BSA+Cytochrome C)

Crosslinked peptides 분석은 서비스로 제공하지 않습니다. 아직까지 분석결과를 도출하는데 있어서 표준화된 프로토콜이 없는것 같습니다.  실험실에서 연구용으로는 가능하지만 분석서비스로 제공하기에는 아직까지는 어렵습니다.  두개의 펩타이드가 crosslinker로 연결되어 있어서 MS2 스펙트럼만으로는 두개의 펩타이드를 동시에 검출하는것이 쉽지 않습니다.  Crosslinker에 따라 MS2 fragmentation 과정에서 crosslinker 여러가지 형태로 펩타이와 결합된 상태로 나타납니다.  검색프로그램이 이것을 모두 고려해서 분석하기에는 제한이 있습니다.

 

 

 

 

차후 분석서비스 가능여부를 확인해보고자 Thermo Fisher사의 DSSO (disuccinimidyl sulfoxide) linker를 이용하여 테스트를 해보았습니다. 단백질과 crosslinker의 농도비율이 아주 중요합니다. 아마 실험자가 최적화를 시켜야 될듯합니다.  저는 두개의 standard 단백질인 BSA 와 Cytcrome C 를 사용였기 때문에 특별히 최적화 과정없이 Thermo fisher사에서 제공하는 프로토콜을 사용하였습니다.

 

DSSO에 대한 프로토콜입니다.

 

Thermo_DSSO_protocol.pdf

0.26MB

 

 

프로토콜은 아주 간단합니다. 두개의 단백질을 적절한 Buffer 조건에서 DSSO와 혼합하여 1시간 정도 반응시키면 됩니다완료가 된 시료는 tryptic digestion 과정을 거쳐서 분석합니다.

 

아래는 DSSO와 반응하지 않은 BSA, DSSO와 반응시킨 BSA, DSSO와 반응시킨 Cytochrome C,  DSSO와 반응시킨 BSA와 CytochromeC  혼합 시료에 대한 크로마토그램입니다.  모든 펩타이드에 DSSO가 결합하지 않기 때문에 DSSO와 반응시킨 단백질과 반응시키지 않은 단백질의 스펙트럼의 모양에는  큰 차이가 없는것 같습니다. 즉 DSSO가 결합되지 않은 펩타이드들이 대부분입니다. 그래서  상대적으로 매우 낮은 양으로 존재하는 DSSO-linked 펩타이드를 검출하는것이 쉽지 않습니다. 

 

 

 

 

하지만 DSSO와 반응시킨 시료에서는 높은 전하를 가지는 피크들이 상대적으로 많이 나왔습니다. 두개의 펩타이드가 결합하여 높은 전하를 가지게  됩니다. 이러한 이유로 DDA 분석에서는 2+를 제외하고 3+ 이상만 검출하는 경우도 있습니다. 최대한 DSSO가 결합된 펩타이드의 검출기회를 높이기 위해서입니다.

 

 

 

DSSO Intra-linked Cytochrome C Peptide

처음 시도에서는  MS2 만으로 분석을 하였기에 crosslinker 펩타이드를 검출하는것이 어려웠습니다.  문헌에 나와 있는 정보를 이용하여 raw 파일에서 찾아보았습니다.  아래 표는 DSSO 가 결합될때 펩타이드에서 증가되는 분자량을 보여줍니다.

아래는  cytochrome C에서 발견한 Intra-linked 펩타이드입니다. GGKHKTGPNLHGLFG 의 두 K 에 DSSO가 intra로 연결되어 있습니다.

 

아래는 GGKHKTGPNLHGLFG-DSSO에 해당하는 MS2 스펙트럼입니다. Precursor ion에서 H2O가 떨어진것 같은 피크가 크게 검출이 되었습니다. 그리고 낮은 intensity로  많은 피크들이 보입니다. 

 

 

아래는 MS2 스펙트럼입니다. Intra-linked 펩타이드 형태이기 때문에 약간은 쉽게 수작업으로 확인을 할수 있었습니다. Lysine이 포함되었는 2+의 fragment ion이 많이 생성되었습니다. 또한 DSSO linker가 절단된후 생성되는 2가지 형태인 Alkene, Thiol 이 펩타이드에 결합된 형태도 발견되었습니다. 

 

DSSO Inter-linked Cytochrome C Peptide

 

이번에는 Inter-linked 펩타이드를 검출하였습니다. 상대적으로 길이가 짮은 두개의 펩타이드가 DSSO로 연결되어 있습니다. GKK-KATNE에 176.0144 Da 을 더한 후 계산한 이론적인 m/z 526.2581(2+)에 근접합니다.

아래는 MS2 스펙트럼입니다. DSSO가 연결된 부분이 두가지 형태 (Alkene, Thiol)로 절단되면서 형성된 전형적인 스펙트럼입니다. 하지만 MS2 스펙트럼만으로는 DB 검색을 통해 검출하는것이 어렵습니다.  

 

일단 MS2를 이용하여 간단히 테스트를 해보았습니다.  다음에는 Orbitrap Fusion의 MS2-MS3과 XlinkX 프로그램을 이용하여 검출 테스트한것을 올리도록 하겠습니다.

 

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