Orbitrap Fusion에서 Intensity Threshold 설정에 따른 펩타이드 검출차이

 

 

LC-MS/MS의 실험조건에서는 Intensity Threshold 가 있습니다. 특히 DDA 분석에서 일정 intensity이상의 피크만을 fragmentation 을 허용하는 조건입니다.

 

Orbitrap Fusion에서의 Intensity Threshold 값 설

이것은 펩타이드가 적절한 높이까지 왔을때 fragmentation을 수행하여 최대한 좋은 MS2 스펙트럼을 얻기위함입니다. 또한 불필요한 피크 특히 background peaks에 대해서 MS2를 수행하지 못하도록 하여 주어진 시간에 최대한 펩타이드만을 분석하기 위함입니다. Background peak는 single charge임으로 MS2가 수행되지 않도록 설정할수 있습니다. 하지만 background peak들은 intensity가 매우 낮고 다른 피크들과 섞어 있어서 single charge임에도 multiple charge로 인식되는 경우가 있습니다.   

 

아래와 같이 아주 낮은 background peaks에서 두개의 single charge 피크가 근접해 있습니다. 파란색, 빨간색 피크끼리가 Pair으로 이루지만 질량분석기는 이것을 인식하지 못하고 바로 옆의 피크를 Pair로 인식하여 double charge로 계산이 되었습니다. 이 경우 질량분석기는 MS2를 수행합니다. 

 

 

최근 질량분석기의 경우 검출속도가 매우 빠르기 때문에 펩타이드를 검출하는데 있어서  Intensity Threshold 영향을 많이 받지 않는것 같습니다.  하지만 가끔은 이 parameter 의 조절로  추가적인 펩타이드를 검출하거나 혹은 더 좋은 MS2 스펙트럼을 얻는데 도움을 줍니다.

 

아래는 Intensity threshold를 5E3 과 5E5로 각각 설정했을때의 blank 스펙트럼입니다. 5E3에서는 많은 피크들이 MS2가 수행되었을을 알수 있습니다. 하지만 5E5로 설정했을때는 일부 피크만이 MS2가 수행되었습니다. 2+ charge 이상만을 MS2를 수행하게 설정했음에도 불구하고 Blank에서  많은 피크들이 MS2가 수행되었습니다.

 

서로 다른 Intensity threshold에 따라 BSA검출은 어떻게 되는지 확인해보았습니다.  아래는 서로 다른 intensity threshold에서 분석한 BSA입니다.

 

 

간단히 Morpheus로 검색을 하여 검출된 펩타이드수와 sequence를 비교해보았습니다.

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아래표에서 보듯이 Threshold에 따라 검출되는 펩타이드의 수가 달라지며 그에 따라 sequence coverage가 달라집니다.

일관성이 없기 때문에 어떤것이 최적화 된것이라고는 말할수 없을것같습니다. 아마 단일 단백질이라서 크게 영향을 받지 않을수도 있을것 같습니다.  하지만 매우 복잡한 시료에서는 이 파라미터가 더 영향을 줄수 있을 것 같습니다. 물론 background peak 들의 검출을 없애기 위해서 intensity threshold를 무작정 높이는것도 좋지 않습니다. 이 경우 매우 낮은 intensity를 가지는 펩타이드의 검출기회를 놓칠수 있습니다. 또한 최근 질량분석기는 감도가 매우 좋기 때문에 낮은 intensity를 가지는 펩타이드에도 좋은 MS2  스펙트럼을 얻을수 있기 때문입니다.  아무튼 동일한 시료임에도 Threshold에 따라 검출펩타이드의 수가 달라짐을 알 수 있습니다. 

 

 

아래는 Instensity Threshold 값을 5E3와 5E5에서 각각 분석한후  m/z 582.에 대한 MS2 XIC 입니다. 동일한 시간에서 MS2가 수행되었음을 알수 있습니다.  

 

 

 

각각에서의 MS2 스펙트럼 intensity를 비교해보면  5E5 intensity threshold에서 더 높은 MS2 intensity를 가집니다. 이것은 아마 m/z 582.2 의 피크가 더 높이 올라왔을때 MS2를 수행하였기 때문일것입니다.

 

 

일반적으로 분석하고자 하는 시료에 대한 method를 이용하여 blank run을 수행합니다. 그리고 전체적으로 background peak의 intensity가 어느정도인지 확인한후 적절한 intensity threshold값을 정하기도 합니다.  장비의 상태나 이동상에 따라 background peak의 intensity가 다를수 있기 때문입니다.

 

Intensity threshold를 적절히 적용하는 방법중 하나는 만약 매우 극미량의 시료의 경우 MS1 resolution을 약간 높인후 intensity threshold를 낮추게 되면 낮은 intensity를 가지는 펩타이드를 검출할수 있습니다. 만약 단일 시료이며 양이 상대적으로 많을 경우 대부분의 펩타이드의 intensity가 높다고 예상될때  intensity threshold를 조금 높이게 되면 펩타이드 피크가 충분히 높이 올라갔을때 MS2를 수행을 함으로써  더 좋은 스펙트럼을 얻을수 있습니다.

 

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