3M C18 Extraction Disks를 이용한 소량 펩타이드 정제

3M C18으로 충진한 Stage-tip 의 펩타이드의 용량 확인

 

실험실에서 펩타이드 정제용인 Stage-tip 컬럼제작에 널리 사용되는 3M™ Empore™ C18 Extraction Disks의 용량 테스트에 관한 내용이다.

 

실험실마다 사용하는 컬럼의 종류도 다양한다.  연구비가 충분한 경우 C18이 충진된 컬럼을 사용하지만 그렇지 않은 경우 대부분 직접 충진해서 사용한다. 이중에서 소량의 펩타이드 정제에 가장 보편적으로 사용하는 제품이 3M™ Empore™ C18 Extraction Disks 이다. (현재  3M™ Empore™ C18 Extraction Disks 은 3M에서 더 이상 생산하지 않고 있다. 하지만 동일한 제품으로 CDS Analytical https://www.cdsanalytical.com/ 에서 구매할수 있다.)

 

보통 200 µl 파이펫팁에 1~3 cm 정도 충진한다. 이 C18 disk는 밀도가 높아서 많이 충진을 하게 되면  높은 압력으로 인해  정제시 불편함이 있다. 그래서 보통 1~3 cm 내외에서 충진해서 사용하다.

 

보통 분석의뢰서비스는  소량의 10 µg 이하의 단백질 정제가 대부분이다.  그 보다 더 많은 양을 정제해야 될경우 다른 컬럼을 사용한다  종종  연구원이나 학생들중에서 자신이 사용하는 C18 Stage-tip의 적절한 펩타이드 용량을 알지 못한채  사용하는것을 보았다. 분석시료의 양이 매우 다름에도 불구하고 일괄적으로 한가지 용량의 컬럼만을 사용한다.  정제후 질량분석기에서 펩타이드 피크가 정상적으로 나오기때문에  별 의심없이 사용하게 된다. 하지만 처음 컬럼에 시료를 loading하고 washing 하는 과정에서 얼마만큼의 펩타이드가 손실되었는지는 알수가 없다. 단백질 정성분석이라면 큰 상관없지만  정량분석이라면  정량값에 큰 영향을 주게 된다.

 

1) 펩타이드 정제를 위한 3M™ Empore™ C18 Extraction Disks 적절양 테스트

 

대체적으로 한 두번의 nano LC-MS/MS 분석에 적절한 양인 3 µg 과 10 µg 을 테스트해 보았다.

아래그림과 같이 직접만든  도구를  사용하여 Disk 에서 서로 다른 양의 C18 (1 punch vs 3 punch) 추출하여 3 µg 과 10 µg 각각 loading 하였다.  loading과 washing후 용리된것을 합친것과  elution 에서 용리된것을 각각 분석하였다. Flow-through 은 전체양의 절반, Elution은 1 µg에 해당하는 양을 주입니다.

 

 

Figure 1. Workflow for the capacity test of 3M C18 Disk

 

이론적으로는 Flow-through에서는 펩타이드가 나오지 않아야 된다.  아래 그림은 Flow-through 와 Elution에 대한 크로마토그램이다.  둘 다 Flow-through 에서는 펩타이드가 거의 나오지 않았으며 Elution에서는 예상대로 펩타이드가 검출되었다.  10 µg 의 Flow-throug에서는 보이는 크로마토그램의 피크들은 펩타이드가 아닌 Single-charge를 가지는 불순물 피크들이다. 

 

Figure 2. Chromatograms of Flow-through and Elution 3 µg HeLa digest (1 Punch)

 

Figure 3. Chromatograms of Flow-through and Elution 10 µg HeLa digest (3 Punches)

이 결과로  3M C18 Disk의 1 punch는 약 3 µg 정도,  3 punch는 10 µg정도  펩타이드를 정제하는데 적절한 한 것같다.

물론 시료의 complexity나 dirty정도에 따라 달라질수도 있을것이다.

 

2) 펩타이드 정제를 위한 타사 C18 Disks 적절양 테스트

3M 사의 제품이 단종되고 CDS Analytical 사에서 다시 제품을 만들기 전까지 대체할 C18이 필요했다. 유사한 제품을 한 회사에서 구매한후  시험해 보았다.

3 Punch로  1, 3, 5 µg 으로 두번씩 테스트 해 보았다. 그러나 3M 제품과는 달리 Flow-through에서 상당한 양의 펩타이드가 검출되었다.  아마 이 회사 제품의 경우 펩타이드의 결합력이 상당히 떨어지거나  3 punch가  1 µg의 

펩타이드를 정제하기에는 적은 양일 수 도 있을것같다.  이 데이타를 보여주고 전량 리턴하였다.

 

 

Figure 4. Chromatograms of Flow-through samples for 1, 3,  and 5 µg  HeLa digest (3 Punches)

 

Figure 5. Chromatograms of Elution samples for 1, 3,  and 5 µg  HeLa digest (3 Punches)

 

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