DIA분석(QE)에 있어서 m/z 500-900 과 mz 400-1000 검색구간에 따른 결과 차이

요즘은 다시 DIA를 기초부터 공부하는기분입니다. 이론적으로 알고 있거나 논문에 이미 결과가 나와 있더라도 직접 운용하는 장비에서는 어떠한지 확인이 필요하다고 생각합니다.  그리고 결과를 정리해 놓아야 다음에 다른 분석에 적절히 사용할수 있을 것 같습니다.

 

초기에는 DIA의 분석구간을 m/z 500-900으로 하였습니다. 일반적으로 DDA에서 사용하는 m/z 300-1500 혹은 m/z 400-1200을 사용하지 않은것은 초기 장비의 한계로 인해 최대한 검색 구간을 줄여서 감도를 향상시키기 위함이 었을 것입니다.  많은 논문에서 Q-Exactive series의 초기 모델인 QE의 경우 이렇게 m/z 500-900 구간을 사용했던 것 같습니다. 보통 tryptic peptide의 경우 m/z 500-1000 사이에서 많이 검출되며 그 외 구간에서는 상대적으로 적게 검출됩니다. 그러므로 적은 수의 펩타이드를 더 검출하기 위해 감도를 희생하지 않는것이 좋다고 생각합니다.

 

아래 그래프는 293T cell을 stage-tip으로 분획하여 QE로 검출후 피크와 펩타이드 m/z의 분포도를 보여줍니다.

검출된 피크와 실제 펩타이드로 검색이 된 피크의 분포도에서 보듯이 m/z 1000 이상에서는 매우 적은양이 검출되었습니다.  m/z 400-500 구간은 상대적으로 많이 검출이 되었습니다.

 

실험실에 QE가 있어서 간단히 m/z 500-900 와 m/z 400-1000 두 구간에서의 결과를 비교해보았습니다.

2 µg 293T cell digest를 20 m/z isolation window로 두개의 다른 구간에서 3번 반복 분석하여 결과를 얻었습니다

 

아래의 그래프에서 보듯이 검출된 단백질의 숫자에는 큰 차이가 없지만 넓은 구간(m/z 400-1000)에서 더 많은 펩타이드가 검출되었습니다. 더 넓은 구간에서 분석하였으니 더 많은 펩타이드가 검출된것은 당연한 결과입니다. 하지만 검출된 펩타이드가 새롭게 검출된 단백질의 갯수를 증가시키지는 못하였습니다. 아마  다른 charge state 를 가지는 동일한 펩타이드가 검출된것이라 생각합니다. 

 

시료에 spiking을 시킨 Ovalbumin  펩타이드의 검출결과입니다. 테이블에서 보듯이 넓은 구간에서 검출된 펩타이드의 수가  더 많습니다. 하지만 동일한 펩타이드의 다른  charge state를 가지는것도 있습니다. 예를 들면 

ADHPFLFC[Carbamidomethyl]IK 의 경우 3+는 m/z 416.5462 입니다. 즉 이 펩타이드는 m/z 500-900 구간에서는 검출이 되지 않고 m/z 400-1000 구간에서만 검출이 됩니다.

 

 

일단 검출된 수만 비교하면 m/z400-1000에서의 결과가 더 좋습니다. 

 

아래는 특정  product ion의 XIC를 보여집니다. 그림에서 보듯이 m/z500-900영역에서는 더 많은 포인트수로 검출이 되었습니다.  즉 구간이 줄어들면 그 만큼 해당 피크의 검출 횟수가 증가됩니다.  정량분석에서는 이 점이 중요합니다.

하지만 m/z 400-1000에서도 대략 10개 이상의 포인트로 검출이 되었으로 정량분석의 정확도에는 큰 문제가 없을것 같습니다.

 

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