Proteome Discoverer에서 Spectra library 기반 MSPepSearch로 단백질 검색하기

Spectra Library 기반 MSPepSearch

Proteome Discoverer에서 Spectra library 을 이용하여 DDA 결과를 분석할수 있습니다. 기존의 검색 엔진인 SEQUEST 나 MASCOT 이 아닌 MSPepSearch를 이용합니다. 기존의 DDA 결과를 통해 검색한 결과를 Spectra library 형태로 만들어 이것을 이용하여 검색합니다.

 

• Spectra Library Download and Import

Proteome discoverer에서는 기본적으로 human proteome에 대한 Spectra librarary를 다운받을수 있습니다.  Proteome Discoverer에서 Spectra libraries->download를 클릭하여 다운받고 싶은 것을 선택하여 다운로드합니다.  필요한 fasta 파일로  포함되어 있기 때문에 따로 다운받을 필요가 없습니다.

 

 

또한 연구자가 추가적으로 원하는 Spectra library를 삽입할수 있습니다.  NIST에서는 MSPepSearch에 필요한 파일 형태를 다운받을수 있습니다. 아래는 NIST 의 웹사이트입니다.

chemdata.nist.gov/dokuwiki/doku.php?id=peptidew:cdownload

 

 

현재 웹브라우저에서 FTP로 다운받는데 제한이 있습니다.  저는 아래 사이트에서 쉽게 다운받을수 있었습니다.

chemdata.nist.gov/mass-spc/ftp/download/peptide_library/libraries/human/HCD/2020_05_19

Spectra library 파일와 fasta 파을 다운받습니다.

 

 

다운로드받은 파일을 Proteome Discoverer에 업로드 하기 위해서는  Spectra Libraries->Add를 하면 아래와 같은 창이 나옵니다. 간단히 정보를 입력하고  해당 spectra library 파일에 그에 해당하는 fast sequence를 넣어주면 됩니다.

 

 

 

Comparision of Different Search Platforms 

MSPepSearch의 기능을 확인하기 위해서 아래와 같이 Proteome Discoverer 2.4에서  4가지의 서로 다른 형태로 검색을 하였습니다.

1.  SEQUEST HT only, 2. MSPepSearch Only, 3.MSPepSearch Spectrum Confidence filter to SEQUEST, 4. SEQUEST and MSPepSEarch Parallel

 

MSPepeSearch에서는 여러개의 spectra library를 동시에 넣을수 있습니다. 일단 NIST에서 다운로드 받은 Human hcd tryp best 파일과 그에 해당하는 fasta 파일을 넣었습니다.  Proteome Discoverer를 통해 다운받은 spectra library의 경우 spectra library를 넣으면 fasta 파일은 자동으로 등록이 됩니다.

 

 

Spectrum Confidence filter를 아래와 같이 설정하였습니다.

 

 

 

Results 

검색후 얻어진 단백질과 펩타이드 수의 비교는 아래와 같습니다. Sequest와 MSPepSearch를 동시에 사용하는것이 각각의 한개를 사용한것보다 조금더 많은 수를 얻었습니다.  흥미로운것은 Spectra library 기반으로 검색한 MSPepSeach에서 Sequest에서 보다 약간 많은수의 단백질과 펩타이드 검출된것입니다.

 

 

MSPepSearch후 Confidence가 High로 검색된것을 제외한것을 다시 Sequenst로 검색하였을때 많은 펩타이들이 Sequest에서 다시 High confidence로 검출이 되었습니다.  

 

 

아래 스펙트럼은 MSPepSearch에서 filter가 된후 다시 Sequest에서 High confidence로 검출된 스펙트럼을 보여줍니다. 

 

 

이 테스트를 통해 Spectra library를 기반으로 한 MSPepSearch 가 단백질과 펩타이드를 추가적으로 검출하는데 도움이 된다는것을 확인하였습니다.