Online SCX trap column 을 이용한 online 2D-LC fractionation

요즘은 소량의 펩타이드를 분획하는 방법이 많이 소개되어 있습니다. 보통 Stage-tip 기반으로 소량의 펩타이드를 분획한 후 질량분석기로 측정합니다. 하지만 가끔씩 이러한 offline  분획이 귀찮을때도 있습니다. SCX 분획은 Salt를 사용하기 때문에 분획후 clean-up 과정이 요구될때도 있습니다.  이때는 각 분획은 하나씩 C18 컬럼으로 clean-up을 해야 됩니다. 이런 과정이 없이 소량의 시료를 SCX로 간단히 분획하여 분석하고 싶을 때는 Online SCX컬럼이 유용합니다. 

 

이전에 한국에서 사용하던 (거의 7~8년이 된것 같네요) SCX trap이  있어서 Ultimate 3000 Dionex LC 에 장착하여 테스트를 해보았습니다.  사용한 컬럼은 아래 그림과 같이 Waters 사에서 구매한  SCX nanoEasy Trap column입니다.

 

 

SCX nanoEase trap column.pdf

0.31MB

이제는 Waters에서는 판매하지 않고 OPIMIZE Technologies에서 OPTI-PAK® Trap Columns 의 이름으로 구매할수 있는것 같습니다 

www.optimizetech.com/opti-pak-trap-columns/

 

Configuration setting

기존의 configuration에서 그림과 같이 SCX를 Loading pump에서 나오는 튜빙에 연결후 10-port 에 장착하면 됩니다.  Viper 튜빙보다는 PEEK 재질의 튜빙이 더 나을것 같긴 합니다. 

 

 

Fractionation

아래와 같이 Autosampler vial에 각각의 buffer를 담은후  Tray에 둡니다.

Buffers : 25% ACN+ 0mM, 50mM, 75mM, 100mM, 150mM, 200mM, 350mM, 500mM Ammonium formate (pH 3.0)

 

Stepwise로 Autosampler 에 있는 buffers를 주입하여 분획을 합니다.  일단 Salt로 용리된 펩타이드는 C18 trap-column에 결합하고 salt는 wasterline으로 빠져나갑니다. 이때부터는 일반 방식으로 진행됩니다.  SCX에 결합한 펩타이드가 충분히 용리될수 있도록 각 buffer는 충분한 volume으로 주입합니다. 보통  20 µL  sample loop가 장착되어있음으로 15~18 µL  를 주입합니다. 또한 용리된 salt가 C18에서 충분히 wash되기 위해서 시료 loading 시간을 충분히 주어야 합니다.

 

Chromatogram

아래는 10 µg mouse liver tissue에 대한 크로마토그램입니다.  Flow-through에서는 검출이 되지 않고 50 mM 부터 펩타이드가 점차 나옵니다. 

 

 

아래는 절반의 양인 5 µg mouse liver tissue에 대한 크로마토그램입니다. 소량의 펩타이드에서도 분획이 잘되었습니다.

 

 

Conclusion

시료의 양이 많을 경우 offline으로 분획하는것이 훨씬 더 좋은 결과를 얻을수 있습니다. 하지만 경우에 따라서 시료의 양이 제한적이거나 원하는 펩타이드를 간단히 분획하여 검출하고 싶을때 online SCX 방법으로 간단히 분석할수 있습니다.