Thermo high-flow Vanquish UPLC 와 TSQ Altis™ Triple Quadrupole을 이용하여 20 분내에 소량 단백질의 정량분석

정량분석을 수행할때 검출감도를 최대한 높이기 위해서 nano UPLC를 사용합니다. 하지만 nano UPLC의 경우 감도가 높은 반면 troubleshooting이 많다는 단점이 있습니다.  요즘은 정량분석을 위해서는  고분해능, 고감도 질량분석기로 인해 정량분석시 PRM분석을 많이 합니다. 이때 보통 nano UPLC를 사용합니다. 

 

2년전에 설치된  Thermo 사의 High-flow UPLC인 Vanquish 와 TSQ Altis™ Triple Quadrupole를 이용하여 nano UPLC에서 사용하는 정도의 단백질  양으로 정량분석을 해보았습니다 (이전에 쓴 글에 대한 업데이트입니다).  기존의 nano UPLC을 이용한 PRM 분석법에 대략 비교를 할수 있을것 같습니다.

 

장비는 아래와 같습니다. 컬럼은 1.9 µm C18, 2.1mm 두께, 15 cm 컬럼을 사용하였습니다.  LC flow rate 은 300 µL/min 를 사용하였습니다. 

 

 

Scheduled MRM of 115 peptides with 2 µg HeLa digest using 20min LC gradient 

시료는 HeLa lysate를 사용하였고 서로 다른 48개의 단백질 에서 115개의 펩타이드/369 transition 이 사용되었습니다.

Nano UPLC에서 일반적으로 주입하는 양인 2 µg 을 사용하였습니다. LC gradient time은 일반적은 nano UPLC 에서 사용하는 60 min 보다 훨씬 짮은 20분을 사용하였습니다.  아래는 2번의 Scheduled MRM 크로마토그램(MS2)을 보여줍니다. 짧은 20분사이에서 펩타이드들이 잘 분리가 되었습니다.

 

 

아래는 Skyline 에서 보여지는 Transition chromatogram을 보여줍니다.  Skyline 분석결과 115 개 펩타이드에서 72개의 펩타이드가 확실히 검출되 었습니다.

 

 

 

높은 유속과 1.9 µm C18 컬럼으로 인해 높은 재현성과 분리능이 보여졌습니다.피크가 14초 내에서 용리됩니다. 

 

 

Schedule MRM에서 retention time windows는 1min, 0.5 min (30초), 그리고 0.25min(15초)로 각각 테스트를 했습니다. 또한 Dwell time(DT)의 경우 50과 100으로 각각 테스트 하였습니다.  Retention time의 재현성과 상대적인 정량값 그래프를 보여줍니다.  높은 retention time 재현성이 나왔습니다. 또한 정량분석값에도 15초의 좁은 retention time  window에도 불구하고 1 min 에서 값과 차이가 거의 없습니다.   Nano UPLC에서는 얻기 어려운 재현성입니다.  Dwell time의 경우 100 ms 과 50 ms 간의 큰 차이가 없습니다. 

 

 

 

 

감도면에서는 nano UPLC에 비해서 High-flow UPLC가 떨어지겠지만 높은 재현성과 높은 피크 분해능이 이러한 단점을 보상해줄것 같습니다. 또한 시료의 양이 충분할경우 nano UPLC에 비해 5배 정도 더 주입하면 nano UPLC만큼의 감도가 나올것이라고 생각합니다.