Data-dependent Acqusition에서 Gas-phase fractionation의 효율성

오래전 질량분석기 장비는 지금과 같이 빠른 속도를 가지지 못했습니다.  한때  Gas-phase Fractionation이라는 방법으로 통해 보다 많은 단백질/펩타이드를 검출하려고 했습니다.  Gas-Phase Fractionaton은 일반적인 물리적 분획(e.g, SCX and HILIC)과는 다르게 질량분석기안에서 이루어집니다.

 

일반적인 프로테오믹스 분석에서는 질량분석기의 Full scan range를 m/z 300-1200로 설정하여  data-dependent acquisition(DDA)로 피크가 높은순으로 펩타이드를 검출합니다. ESI 스펙트럼은 가장 높은 피크를 100으로 두고 나머지는 상대적인 값으로 보여집니다. 즉 주위에 큰 피크의 높이에 따라 나머지 높이가 낮은 펩타이드의 상대적인 높이가 달라집니다.  Full scan에서 많은 피크들이 동시에 나오게 되면 아주 낮은 높이의 펩타이드는 DDA에서 검출이 안될 가능성이 있습니다. 특히  질량분석기의 속도나 감도가 낮은 경우 이 영향이 큽니다.

 

이러한 문제를 조금이나마 해결하기 위해서 Gas-Phase fractionation 방법을 사용하였습니다. 즉 m/z300-1200 의 full scan을 사용하는것이 아니라 좁은 영역 예를 들면 m/z 300-400, m/z 400-500, m/z 500-600 , m/z 600-700 

m/z 700-800,m/z 800-900,m/z 900-1000, m/z 1000-1200, 등으로 나누어서 동일한 시료를 여러번 분석하는 것입니다.

 

좁은 영역의 Full scan을 사용함으로써 큰 피크들로 인한 방해를 줄일수 있게 됩니다. 단 동일한 시료를 여러번 주입해야 함으로 장비사용 시간이 늘어난다는 단점이 있습니다. 

 

Gas-Phase Fractionation

하지만 요즘은 질량분석기의 감도가 예전에 비해서 월등히 증대되어서 이러한 분획이 필요하지는 않을것 같습니다.   혹시나 하는 생각에 간단히 테스트를 해보았습니다.  Promega 사의  Yeast 와 HeLa lysate를 Tryptic digestion하여서 GPF 의 효율성을 테스트해 보았습니다.

 

아래는 GPF 없이 하나의 full scan range로 분석한 Yeast digest의 크로마토그램입니다.

 

 

 

 

아래는 GPF를 이용하여 서로 다른  full scan 구간에서 Yeast digest 얻어진 크로마토그램입니다.  구간에 따라 피크의 분포도가 다릅니다. 상대적으로 m/z 300-400 과 m/z400-500 구간에 많은 펩타이드 피크들이 밀집해 있습니다.

 

동일한 방법으로 HeLa digest로 분석하였습니다.  아래는 각각에 방법에서 검출된 단백질과 펩타이드 수에 대한 비교 그래프입니다.

 

The number of proteins and peptides between GPF and no-GPF, Yeast digest

 

 

The number of proteins and peptides between GPF and no-GPF, HeLa digest

 

이 테스트에서는 GPF에 대한 효과를 보이지 않았습니다. 오히려 검출된 단백질과 펩타이드의 수가 상대적으로 더 적었습니다.  이유는 잘모르겠으나 질량분석기의 속도가 충분히 빠르기 때문에 굳이 GPF 방법을 하지 않아도 용리되는 펩타이드를 대부분 검출할수 있기 때문이라 생각합니다.