SDS buffer가 들어간 펩타이드 분석 (실패경험)

얼마전에 시료에 SDS buffer가 있다는 사실을 깜박하고 분석을 하였습니다. 시그널이 나오지 않아서 시료의 문제나 혹은 시료 전처리 과정에서 실수가 있다고 생각하였습니다. 상대적으로 complex 한 시료임에도 불구하고 아래와 같은 크로마토그램이 나왔습니다.  보이는 피크들은 모두 Single charge를 가지는 chemical  혹은 background peak들입니다.

 

 

Trion X-100과 같은 detergent가 시료에 존재할 경우 아래 그림과 같이 크로마토그램에서 구별가능한 피크들이 보이게 마련입니다.  하지만 SDS가 존재할 경우 ion suppression으로 인해 피크들이 아예보이지 않게 됩니다. 

https://en.wikipedia.org/wiki/Ion_suppression_in_liquid_chromatography%E2%80%93mass_spectrometry

 

 

 

문제점 발견하기

이럴때는 무엇이 문제인가를 하나씩 찾아나가는것이 중요합니다. 먼저 스펙트럼에서 trypsin 피크가 있는지 확인해 보았습니다. 하지만 일반적으로 발견되는 trypin 피크가 나오지 않았습니다. 시료자체에 단백질이 없었더라도 일반적으로 trypsin 피크는 발견됩니다. 특히 시료에 단백질의 양이 실제 양보다 적을 때는 Trypsin 피크가 상대적으로 더 크게 보이게 마련입니다. 

 

QC standard로 장비자체는 문제가 없다는것이 확실합니다. 일단 시료에 단백질의 양이 적었거나 전처리과정에서 문제가 있었을 것이라고 생각하고 두번째 시도에는 standard 단백질 을 첨가하였습니다. 하지만 재 분석후에도 여전 시그널이 나오지 않았습니다.

 

 

15년 이상의 전처리 경력이 있는데 단순한 C18 clean-up에서 실수가 있지 않았을 것입니다. Standard 단백질도 검출이 되지 않은것으로 일반적인 실수에 의한 문제는 아닌것 같습니다. 곰곰히 생각한후 이메일을 하나씩 체크해보았습니다.  그제서야 시료에 SDS buffer가 있었다는것을 알게 되었습니다.

 

 

Removal of the SDS with SCX column

S-trap 으로 전처리를 하면 문제가 없습니다. 하지만 그전에 펩타이드와 SDS buffer가 혼합되어 있을때 간단하게나마 SDS를 제거할수 있는 방법을 생각해보았습니다.  Digestion 되어 있는 시료를 C18이 아닌 SCX 컬럼으로 다시 분리해보기로 하였습니다.  하지만 아래 크로마토그램에서 보듯이 SCX로 clean-up한 시료에서도 펩타이드는 검출되지 않았습니다. SCX에서 분리가 되지 않은것인지 그전에 이미 시료의 손실이 있었던것인지는 알수 없습니다. 

 

 

S-trap Digestion 

다시 처음부터 전처리를 하여 S-trap으로 분석하였습니다. 아래와 같이 정상적으로 펩타이들이 검출되었습니다

 

  본의 아니게 SDS가 첨가된 시료를 분석하게 되어 새로운걸 배우게 되었습니다.