Chymotrypsin의 "Semi" cleavage 를 이용한 단백질 검출 I

Recombinant proteins의 sequence를 확인하는 의뢰가 들어왔습니다. 아주 명확한 단일 밴드의 Gel 입니다. 분자량이 상대적으로 작은 단백질입니다. Trypsin으로분석한후 단백질을 검출하였지만 C-terminal 영역은 trypsin으로 분석이 불가능하여 chymotrypsin으로 다시 분석하였습니다.  아래는 크로마토그램입니다.  단일 단백질임을 감안하면 좋은 크로마토그램을 얻었습니다.

 

Proteome Discoverer로 분석하였으나 기대와는 달리 단지  4 개의 펩타이드만 검출이 되었습니다. 검출된 펩타이드의 스펙트럼도 좋지 않았습니다.  크로마토그램 상에서 나온 피크들이 해당 단백질이 아니라 다른 단백질일것을 예상하였으나 다른 어느 sequence에서도 검출이 되지 않았습니다.

 

 

이번에는 검색조건을 Full chymotrypsin 에서 semi로 수정하여 검색하였습니다. 

결과는 아래와 같이 100% sequence coverage가 나왔습니다. 단일 단백질의 sequence를 사용하였기 때문에 false-positive가 많은 것을 감안하더라도 크로마토그램상의 피크에 상응하는 결과가 나왔습니다. 

 

C-terminal 영역중에서 이론적으로 검출되어야 할 펩타이드 Sequence의 길이보다 조금더 긴 펩타이드가 검출이 되었습니다. 아래와 같이 이론적인 스펙트럼과 잘 일치되었습니다.

 

 

재확인을 위해서 이 펩타이드의 m/z에 해당하는 값으로 PRM을 수행하였습니다. 아래와 같이 예상한 펩타이드가 검출이 되었습니다

 

 

 

실험직전 구매한 구입한 chymotrypsin 을 사용하였습니다. 이유는 잘 모르겠으나 제대로 cleavage가 안된것 같습니다. 그래서  검색시 “Semi” 옵션이 도움이 되었습니다.

 

관련글

Proteinase K and Pepsin Digestion with BSA standard

Proteinase K and Pepsin Digestion with BSA standard

Chymotrypsin의 "Semi" cleavage 를 이용한 단백질 검출 II

 

Chymotrypsin의 "Semi" cleavage 를 이용한 단백질 검출 II

Chymotrypsin의 "Semi" cleavage 를 이용한 단백질 검출 I

Promega사의 rAsp-N(P/N VA116A)의 사용후기 및 적용방법

데이타베이스 검색조건에서 Enzyme의 Semi 옵션으로 N-terminal 펩타이드 검출하는 법

데이타베이스 검색조건에서 Enzyme의 Semi 옵션으로 N-terminal 펩타이드 검출하는 법

데이타베이스 검색조건에서 Enzyme의 Full 과 Semi 의 차이 알아보기