데이타베이스 검색조건에서 Enzyme의 Full 과 Semi 의 차이 알아보기

질량분석기를 통해 얻은 raw 파일은 데이타베이스를 통해 단백질을 동정합니다. 이때 데이타베이스 프로그램의 파라미터중 enzyme 부분이 "Full" 이 Default 값으로 정해져 있습니다.  이것은 해당 enzyme이 단백질을 이론적으로 절단할 수 있는 아미노산 사이트만 고려하여 검색하는 것입니다. 하지만 실제 Digestion중에서는 우리가 생각하지 못하는 일들이 일어납니다. 불안전한 digestion 혹은 필요이상으로 incubation 시켰을때도 이론적인 경향에서 벗어나는 경우도 있습니다.  이러한 이유로 종종 "Full"이 아닌 "Semi"로 변경하게 되면 "Full"에서는 발견되지 않은 펩타이드들이 종종 발견됩니다. 이 방법은 정제가 잘된 단일단백질에 적용이 잘됩니다. SDS-PAGE 에서 아주 진한 단일 밴드로 보이는 경우입니다. 

 

종종 분석의뢰자들은 자신들이 정제한 단일 단백질에서 최대한 많은 펩타이드를 검출하기 원하거나, 새로운 PT 사이트를 찾거나 또는 isoform 단백질들 중에서 차이나는 부분만을 선택적으로 검출하기 원합니다.   이때 보통 시료의 종 (species) 전체의 fasta가 아닌 단일 단백질 fasta 파일을 사용합니다.  이럴때  "Full"이 아닌 "Semi"로 검색하면 의의로 새로운 펩타이들이 많이 검출되었습니다. 

 

아래는 standard  BSA의 raw 파일을  Trypsin "Full" 과 "Semi" 로 각각 검색했을때의 결과입니다.  Sequence coverage는 동일 하지만 검출된 unique peptides수가 "Semi"에서 증가되었음을 볼수 있습니다 (# Unique Peptides : 61 vs 179)

동일한 결과 파일에서 검색조건만 변경했음에도 추가로 검출되는 숫자가 증가되었을 알 수 있다.  

 

Figure 1. BSA results with a trypsin "Full"

 

Figure 2. BSA results with a trypsin "Semi"

 

물론 추가로 검출된 펩타이드중에는 false-positive가 많이 포함되어 있을 수 있습니다. 그러므로 manual inspection 을 통해 확인을 해야 합니다. 아래 그림은 Proteome discoverer에서  "Semi" 로 검색후 검출된  펩타이드인 SLHTLFGDEL 의 MS/MS 스펙트럼입니다. Seuqnece에서 보듯이 trypsin의 절단 사이트는 K 나 R이 아닌 L 입니다. 즉 non-trypsic peptide 형태입니다. (Figure 3). Basic site인 K 나 R이 C-terminal에 없어서 인지 일반적으로 y-ion이 많은 스펙트럼과는 다릅니다. b-ion이 더 많이 매치 되었습니다.  Proteome Discoverer로 검색한 결과는 일단 잘 매치가 된것같습니다.

 

 

Figure 3.  Results  with a trypsin "Semi" for SLHTLFGDEL

 

재확인을 위해  raw spectra를 이용하여 이론적으로 생성되는 b-ion에 해당하는 피크를 수작업으로 체크했습니다.  아래 그림에서 보듯이 수작업으로 확인한 스펙트럼은 Proteome Discoverer에서 검출한것과 동일합니다.  즉 Trypsin Full에서 찾을수 없었던 펩타이드를 Semi 조건에서 검출이 되었음을 확인하였습니다.

 

 

Figure 4.  Manual validation of SLHTLFGDEL

 

분석의뢰자들은 자신들의  타겟단백질에 대해 최대한 많은 정보를 얻기를 원합니다. 그래서 검색시 "Full" 과 "Semi" 동시에 검색한후 더 많은 정보의 결과를 제공하는 편입니다.

 

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