LC Gradient 길이에 따라 검출되는 단백질의 수는 얼마나 차이가 나는가?

"LC Gradient를 증가시키면 얼마만큼의 단백질을 더 검출할수 있을까?"

 

 

분석의뢰자로부터 자주 듣는 질문중 하나는 " 몇개의 단백질이 검출되느냐" 입니다. 네이쳐나 기타 좋은 논문에서 봤던 엄청난 수의 단백질을 사뭇 기대하고 묻는 질문일 경우가 많습니다. 하지만 검출될수 있는 수는  sample type, complexity 등에 따라 천차만별입니다. 검출되는 단백질의 수는  다른 모든 조건이 동일하다면 특정 시간에 LC에서 용리된 펩타이드들이 질량분석기에서 얼마나 많이 측정될수 있는가에 많이 의존합니다. 물론 질량분석기의 감도가 좋거나 아주 최적화된 조건에서는 더 많이 검출하지만 질량분석기를 매번 바꿀수도 없고  조건도 매번 바꾸지 않습니다.   그래서 LC gradient 시간을 증가시키면 검출되는 펩타이드의 수가 증가됩니다. 

 

분리가 잘 될 수록 특정시간에 LC에서 용리되는 펩타이드의 수가 줄어들기 때문에 질량분석기가 측정하는데 드는 용이합니다. 그렇다고 무작정 LC gradient 시간을 증가시킨다고 좋은것은 아닙니다.  일정 수준이상이 되면 더 이상 검출되는 수가 증가하지 않습니다.  또한 증가된 장비시간에 비해 추가로 검출되는 단백질의 수가 크지 않다면 불필요하게 시간을 증가시킬 필요가 없습니다. 정해진 시간에 분서할 수 있는 시료의 수도 줄어들게 됩니다. 오후일찍 끝내서 퇴근할 수 있는 일을 굳이 저녁까지 앉아서 분석할 필요가 없지요. 

 

보통  In-gel band는 보통 30 min gradient면 충분합니다.  하나의 밴드에서도 종종 1000개 이상의 단백질이 검출되곤한다.  하지만 소요되는 시간에 따라 검출될 수 있는 단백질의 대략의 수를 알고 있으면  분석의뢰자들에게 대략의 수치를 예상하게 할 수 있습니다.  네이쳐 논문하나를 들고 와서 유사한 결과를 얻기 원하는 분들에게 아주 유용합니다. 

 

그래서 대략적인 가이드라인을 알려주기 위해 간단히 측정해보았습니다.  Promega사에서 판매하는 Human(K562) protein extract 를 trypsin digestion한 후 각각 60, 90, 120, 180분의 LC gradient로 각각 측정해보았습니다. 상세한 정보는 아래와 같습니다.

 

• Sample: Promega HeLa extract (P/N V7341)
• Instruments:  Dionex Ultimate 3000 RSLC + Orbitrap Fusion (OT-IT mode)
• Column: 75 um x 30 cm, C18, 2.4 um, self-packed
• LC gradient: 60min, 90min,120min, and 180min 

 

Figure 1. Protein Identification at different LC gradients

 

60, 90, 120, 180분에서 분석한  Base-Peak chromatogram은  아래와 같다 (Figure 2). 전반적으로 피크들이 넓게 퍼져있고 피크모양도 좋습니다.  LC의 길이에 따라 질량분석기의 검출조건도 약간씩 조정하면 좋았겠지만 일단 LC gradient만의 조건을 비교하기 위해서 다른 조건은 동일하게 사용하였습니다. 

 

 

Figure 2, Base-peak Chromatograms at different LC gradients

각각의 raw 파일을 Proteome discoverer로 분석하여 검출된 단백질과 펩타이드 수를 확인하였습니다.

검출된 단백질 및 펩타이드 수는 아래와 같습니다 (Figure 3).  

 

 

Figure 3. Number of Identified Proteins and Peptides at different LC gradients

 

 

 

예상과 같이 LC gradient가 증가 할수록 검출되는 단백질 수는 증가하였습니다.  

Figure 4. The curve of protein and peptide number at different LC gradient.

일반적으로 In-gel band는 30 min gradient, 분획한 시료는 60 or 120min gradient (분획당)를 사용합니다. 분획하지 않은 단백질의 경우 많은 수의 단백질 검출이 필요하거나 Label-free quantitation을 수행할때는 3시간을 사용합니다. 사실 3시간 이상은  잘 사용하지 않습니다.  같은 양을 주입하는 것이라면 gradient의 길이에 따라 MS parameter 들 (예, TOP N, MIT, AGC등)을 최적화하면 더 좋은 결과를 얻을수 있을것입니다.

 

최근 논문에는 아주 짮은 시간에도 아주 많은 단백질이 검출되는것을 보았습니다. 하지만 아마 장비의 상태가 아주 좋고 조건도 디테일하게 최적화가 되어 있었을 겁니다. 분석서비스를 해야 하는 상황에서   매번 최적의 상태로 장비를  유지할 수가 없기 때문에 위의 정도의 단백질 수이면 충분하다고 생각합니다.