Standard BSA digest 로 LC 장비, 컬럼, 질량분석기 상태확인는 법

간단한 방법으로 장비상태를 확인하여 최적의 장비상태를 유지하기

 

항상 최적의 장비상태로 분석을 하면 얼마나 좋을까 생각합니다. 하지만 어쩔수 없이 일정 시간이 지나면 장비의 감도는 떨어지게 마련이며 그때 마다 장비를 분해해서 클리닝을 할 수도 없습니다.  이러한 상황에서 실험을 하다 보면 장비의 감도가 얼마나 되는지 모르는 상태에서 분석을 하게 됩니다.  실험이 끝난후에야 알게 되면 더욱 난처합니다. 결과가 좋지 않아서 시료의 탓을 하게 되는 경우도 있습니다.  이러한 이유로 장비의 상태를 매일 확인하는것은 귀찮은 일이지만 필수적인 업무입니다.

 

실험실마다 장비의 상태를 체크하는 방법이 있을것입니다.  그중에 Standard BSA (New England BioLabs, P8108S)를 이용하여 매일의 장비 (nano LC와 질량분석기) 상태를 점검하는 방법을 나누고자 합니다.   대략 66 kDa인 BSA는 60여개 이상의 다양한 길이의 tryptic peptides가 생성되기 때문에서 LC 와 MS 시스템을 점검하기에 알맞습니다.  Tryptic digestion이 된 Standad BSA는 동결건조된 상태이며 Salt, glycerol 및 기타 detergents가 포함되어 있지 않습니다. 500 pmol 의 농도이며 100fmol로 묽혀서 사용하면 됩니다. 보통 nano-LC-MS 시스템에서 100fmol을 주입합니다.  

 

• Stanard BSA  (New England BioLabs, P8108S)
• 100fmol/ul, 1 ul injection
• UltiMate™ 3000 RSLC coupled to Q-Exactive HF
• Proteome Discoverer 2.3

Step1.

BSA를 주입하여 얻을 수 있는 첫번째 정보는 LC와 컬럼의 상태입니다. 피크에 tailing이 없고, 전반적으로 피크들이 넓게 퍼져서 잘 분리가 되어 있어야 합니다. 만약 피크의 모양이 좋지 않거나 피크들이 분리가 잘되지 않고 특정 시간에 몰려서 나오면 컬럼과 LC 시스템을 점검해야 됩니다.   아래 크로마토그램은 30분 gradient에서 얻어진 크로마토그램입니다.

대략 보아도 잘 분리가 된것 같습니다. 즉 컬럼과 LC에는 큰 문제가 없음을 알 수 있습니다.

 

Figure 1. Base-Peak chromatogram (UltiMate™ 3000 RSLC coupled to Q-Exactive HF)

 

 

아래는 점검이 필요한 크로마토그램의 예입니다.  아래  왼쪽의 크로마토그램의 경우는 전반적으로 피크들이 왼쪽으로 편향되어 있습니다. 각각의 피크모양은 위에 크로마토그래피에서는 약간 넓은 편이지만 전반적으로는 괜찮습니다. 하지만 약간 왼쪽으로 편향되어 있기에 LC 시스템에서 gradient조건을 조정해야 할 필요가 있습니다. 피크 모양도 조금더 좋아지면 좋을듯합니다. 오른쪽은 몇개의 피크들만 보입니다. 이 경우에는 컬럼과 LC에 문제가 있음을 알 수 있습니다.  

 

 

 

Step2.

두번째로 질량분석기 점검으로 넘어갑니다. 얻어진 raw 파일을 프로그램으로 검색을 하여 검출되는 펩타이드수와 Sequnce coverage를 확인할 수 있습니다.  하지만 그전에 Thermo 장비의 경우 QualBrower에서 대표적인 BSA peak들의 XIC를 체크함으로써 전반적인 피크의 감도를 확인 할 수 있습니다. 이를 통해 질량분석기의  MS1에 관련된 장비의 감도상태를 확인합니다.  피크의 높이는 질량분석기의 감도와 관련이 있지만 피크의 모양과도 관련이 있습니다.  피크의 모양이 넓으면 그만큼 높이는 줄어들게 됩니다. 그래서 step1에서 피크모양을 확인하여 이상이 없을 경우에 한해서 step2로 넘어가서 질량분석기의 감도를 확인합니다. 장비에 따라 감도가 다르기 때문에 각 장비별로 피크의 높이를 체크합니다.  보통 QE 시리즈나 Fusion 의 경우 100fmol BSA에서 1~5E8정도 측정됩니다.

 

 

BSA_layout.lyt

0.02MB

Figure 2. XIC of representative BSA peaks

Step3.

XIC로는 MS1의 감도만 확인이 가능며  MS2에 관한 정보는 얻을수 없습니다.  데이타베이스 검색을 통해 전반적인 상태를 확인 할 수 있습니다  장비상태가 좋았을때에 얻은  BSA의 sqeuence coverge와 펩타이드 갯수와 비교하면 됩니다.  Proteome Discover (Thermo Scientifc) 프로그램으로 검색한 결과는 아래와 같습니다. 상태가 좋은 조건에서 약 80~85% 이상의 sequece coverage를 가집니다. 보통 장비의 감도는 하룻밤사이에 급격히 떨어지지 않기 때문에 매번 하지 않기도 합니다.

 

Figurer 3.  BSA sequence coverage of 100fmol BSA. Proteome Discoverer 2.3

관련글

RawBeans: A Simple, Vendor-Independent, Raw-Data Quality-Control Tool
시스템 상태와 분석법 최적화를 위한 QC 검증 툴-Proteomics Quality Control (PTXQC)

시스템 상태와 분석법 최적화를 위한 QC 검증 툴-Proteomics Quality Control (PTXQC)

Promega 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 를 이용한 시스템 QC
Standard BSA digest 로 LC 장비, 컬럼, 질량분석기 상태확인하는 법

Standard BSA digest 로 LC 장비, 컬럼, 질량분석기 상태확인는 법

장비상태 확인을 위해 Standard BSA를 이용한 Unscheduled PRM 분석법

장비상태 확인을 위해 Standard BSA를 이용한 Unscheduled PRM 분석법

Pierce™ HeLa Protein Digest Standard (P/N 88329)로 장비상태 확인하는 방법

Trap-column 상태확인하는 방법 (Checking efficiency of trap-columns)