Pierce™ HeLa Protein Digest Standard (P/N 88329)로 장비상태 확인하는 방법

앞에서 이야기했듯이 장비의 상태를 점검하는데 단일 단백질인 BSA standard가 가장 널리 사용된다.

하지만 BSA는 단일 단백질이기 때문에 장비의 감도가 약간 좋지 않아도 여전히 좋은 결과를 얻을때가 있다.

 

Complex 한 시료분석을 통해 검출되는 단백질수/펩타이드 수를 통해 장비의 감도를 확인할수있다. 또한 실제 complex한 시료를 분석하기 전에 LC gradient 를 최적화 할 수 있다.  

 

이를 목적으로  Pierce™ HeLa Protein Digest Standard  를 사용하고 있는데 보통 아래의 경우에 사용한다.

1)새로운 장비를 설치 한후

2)LC troubleshooting후 확인

3)질량분석기 내부 청소후 

4)Complex 분석시료 분석전 최적화

5)많은 시료수를 장기간 분석시 batch 사이에 

 

한 Vial당 20ug에 200ul buffer (0.1% Formic acid or 0.1% TFA)를 첨가하여 100ng/ul stock solution을 만든다.

만약 높은 농도의 stock solution을 만들기 위해서 더 적은 volume을 첨가하면 된다. 하지만 Vial안을 보면 white powder가 바닥 표면에 아주 얕게 분포되어 있다. 그래서 만약 적은 volume을 사용하게 되면 vial 표면에 buffer가 뭍어서 많은 손실이 발생한다(실제로 첨가양 양보다 훨씬 적은양이 회수될것이다).   그래서 200 ul정도를 사용해서 100ng/ul로 만든후 2ul 를 주입한다 (200ng on-column)

 

3가지 질량분석기(Fusion, classic QE, and QE-HF)로 60min gradient로 분석하였다. 분석시 LC gradient는 최대한 최적화 한 후 분석한다. 

1) Orbitrap Fusion with Easy nLC 1000 ( 오래사용한 장비이며 S-lense cleaning 후 분석, OT-IT mode)

2) Classic Q-Exactive with Easy nLC 1000 ( 새 장비 설치후 분석)

3) Q-Exactive HF with Dionex ( Refrefurbished, 엔지지어  점검 통과후 분석)

 

 

 

Figure 2. Chromatogram of 200ng HeLa digest acquired with Easy nLC  1000 coupled to Orbitrap Fusion

 

 

 

Figure 2. Chromatogram of 200ng HeLa digest acquired with Easy nLC  1000 coupled to Q-Exactive

 

Figure 3. Chromatogram of 200ng HeLa digest acquired with Easy nLC  1000 coupled to Q-Exactive HF

아래 그래프는  Proteome discoverer 2.3으로 분석한 단백질, 펩타이드, PSM, 그리고 MS/MS spectrum 수 비교결과이다.

대략 3000개의 단백질이 검출된다. 경험상으로  괜찮은 장비 상태에서 3,000개 정도의 단백질이 검출된다. 하지만 계속 사용하다 보면 2,500~3,000 정도가 된다.  만약 괜찮은 chromatogram에서 2,000개 이하로 검출되면 질량분석기의 감도가 떨어지고 있다고 본다.

 

한가지 더 체크해보는것은 MS/MS spectrum 수에 대한 PSM 수의 비율이다.  OT-OT mode (Fusion OT-OT mode or QE series)의 경우  MS/MS spectrum 수에 대비해 대략  PSM수가 대략 50% 이상이 되면 좋은 상태라고 생각한다.

물론 전문가들이 질량분석기의 조건을 최적화하면 그 이상이 될수는 있으것이다. 하지만 쉬지 않고 장비가 운용되어야 하는 일반적인 실험실의 환경에서는 쉽지 않을 것이다. 

 

프로그램을 통한 결과분석외에도  raw 파일을 대략 훓어보면서도 체크가 가능하다. 예를 들면 아래 MS/MS spectum에서 보듯이 presusor ion m/z 903.5411가 MS2 에서 높은 intensity로 보이는 경우가 있다.  Qual Browser에서 체크하면서 대부분의 spectrum이 이런 패턴을 보이게 되면 fragmentation 에 뭔가 이상이 있는것이다. 이러한 spectrum에도 검색 프로그램에서는 정상적으로 peptide 로 검출이 됨으로 직접 체크하기 전까지는 확인하지 못할수가 있다.

 

 

Figure. High dominant precursor ion peak in the MS2 spectrum

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