장비상태 확인을 위해 Standard BSA를 이용한 Unscheduled PRM 분석법

일반적으로 장비상태 점검을 위한  BSA 분석은 Data Dependent Acquisition (DDA) 방법을 이용합니다. 이를 통해 검출가능한 모든 펩타이드를 검출하고 이에 따라  BSA의 Sequence coverage 및 검출된 펩타이드를 점검합니다.  하지만 DDA의 경우 종종 연속적인 분석에 있어서 bias가 있을 수 있습니다.  즉 상대적으로 낮은 피크의 경우 반복적인 실험에서 일괄적으로 나오지 않을수 있기 때문입니다. (하지만 장비상태를 점검하는데는 아무런 문제는 없습니다)

 

Parallel reaction monitoring(PRM)은 특정한 펩타이드만을 연속적으로 측정하기 때문에  bias가 적어 반복실험에서 일괄적인 결과를 도출할 수 있습니다. 이로 인해 장비의 감도를 보다 정확히 추적할 수 있습니다. DDA의 경우 MS2의  intensity가 떨어지더라도 DB 검색에서 펩타이드로 검출이 됨으로 상대비교가 쉽지 않을 때도 있습니다. 그러나 PRM은 연속적인 MS/MS spectrum을 측정하여 integration하기 때문에 MS2 quality를 보다 정확하게 체크할수 있습니다. 만약 MS1 intensity는 정상이나 상대적으로 MS/MS intensity가 낮은 경우  S-lense 쪽이 아닌 더 안쪽이 오염되어 있다고 예상할수 있습니다. 만약 High quality MS/MS spectrum이 요구되는 실험의 경우  PRM method로 사전 점검해보는것도 좋은 전략입니다.

 

아래는 PRM 분석을 위해 필요한  BSA target 펩타이드 리스트를 만들기 위한 skyline template입니다. (아래 다운로드)

BSA_unscheduled_PRM.zip

0.02MB

여기서는 19개의 대표적인 BSA tryptic 펩타이드를 선정했습니다. DDA분석을 통해 가능하면 다양한 Retention time을 가지며 높은 intensity를 가지는 펩타이드를 고릅니다.

 

 

Figure 1. Skyline Template for a BSA PRM

File-Export-Isolation List 를 선택합니다.

 

Figure 2. Creating BSA PRM target List

장비에 맞는 instrument type과 single method을 선택합니다. Retention time을 고려하지 않은 unschedule method

Method type에서 Standard를 선택합니다.

Figure 3. Creating BSA PRM target List

 

적절한 파일이름으로 저장합니다.(확장자는 csv 파일입니다)

Figure 4. A CSV file including BSA PRM Peptide list

이제 Xcalibur에서 PRM method를 만들어야 합니다.  아래와 같이  "Full MS (Full MS-SIM을 선택)" 와 PRM  method를 선택합니다.

Figure 5.  A creation of BSA PRM method

Full MS 와 PRM method의 Parameter는 아래와 같습니다   일반적인 값들이며 필요에 따라 수정하면 됩니다.

Figure 6.  Full MS Parameters

Figure 7.  PRM MS2 Parameters

이제  Skyline에서 export한 CSV 파일을 inclusion list에 import하면  됩니다.  Global List - Inclusion list- Method editor-File-Import-"저장한 파일" 선택

 

Figure 8. Importing of an including the list

아래는 importing 된  Including list입니다.

Figure 9. An Including list of BSA peptides

PRM의 경우 Internal lock mass 를 사용하면 보다 accuracy한 피크를 생성할 수 있습니다.  Global List - Lock Masses -> "445.12003"( polydimethylcyclosiloxane). 장비의 accuracy가 떨어지는 정도를 체크가히 위해서는 internal loc mass를 사용하지 않으면 됩니다.  보정되지 않은 실제 값을 측정할수 있습니다.

Figure 10. A setup of Lock Masses

단 반드시   Global settings-Use lock masses 에서 off에서 best로 바꾸어 주어야 기능이 활성화 됩니다.

Figure 11. A setup of Lock Masses

아래 그림은 Unscheduled PRM으로 얻어진 19개의 BSA 펩타이드에 대한 크로마토그램입니다.

 

Figure 12. PRM Chromatogram of 19 BSA Peptides

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