ProteinProspector 를 이용한 특정 Enzyme에 대한 단백질의 예상 절단 펩타이드 확인하는 법

ProteinProspector

 

IP 시료등 단일 표적 단백질의 분석을 진행하기 전에 반드시 거쳐야 할 과정은 적절한 enzyme 을 찾는것이다.

일단적인 단백질 동정분석에서는 trypsin이 큰 문제가 없으나 특별한 분석이 요하는 경우  trypsin이 적절치 않을때가 있다.

 

1) Protein N-terminal peptide의 PTM 여부 (e.g acetylation)

2)특정 염기의 PTM 여부 

3)여러개의 Isoform 단백질을 구별하기 위한 특정 sequence 분석

 

이런 분석을 위해서는 다른 sequece 검출여부와는 상관없이 원하는 sequence를 질량분석기로 검출해야 된다.

질량분석에 원하는 영역이 적절한 길이 (8~20 염기)의 펩타이드가 생성되는지 확인할때 이 툴이 아주 유용하게 사용된다. 분석의뢰자들에게도 소개하여 분석의뢰전 의뢰자 자신들이 가장 적절한 enzyme을 찾도록 한다.

 

먼저 사이트(http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)에 접속한후 초기화면에서 "MS-Digest" 선택

 

 

 

아래화면은 default 화면이다.  Digest 에서 원하는 enzyme을 선택하고 Variable Modes 는 모두 unchecked로 바꾼후(회색이 모두 없어지도록) Max.Missed Cleavages로 1에서 0으로 바꾼다.  만약 default값으로 하게 되면 가능한 모든 펩타이드가 보여주게 되어 체크가 쉽지 않다. 그리고 하단의 User Protein Sequence에 본인의 단백질 sequence를 붙혀넣기한다.(Sequence 사이에 스페이스가 없어야 된다). 다른값들은 수정하지 않아도 된다. 준비되면 Perform Digest 클릭

 

 

 

아래는 trypsin (위) 와 Glu-C (아래)로 절단 했을때의 이론적인 펩타이드 리스트이다. 여기에 이론적으로 생성될수 있는 모든 펩타이드와 정보를 보여준다.  두개를 비교해보면 서로 다른 펩타이드가 생성되는것을 알 수 있다. 

 

 

Trypsin digestion

 

Glu-C digestion

 

만약 이 단백질의 Protein N-termini의 acetylation 여부를 확인하고자 한다면   trypsin (AVVLTLAVLFLTGSQAR) 보다는 Glu-C (MKAVVLTLAVLFLTGSQARHFWQQD)가 적절하다는것을 알수 있다.