Promega 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 를 이용한 시스템 QC

시스템 QC 용으로 Promega사의  6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 를 구매하여 테스트 하였다.

 

일반적으로 System Suitability 체크용 Standard 펩타이드의 경우 서로 동일한 농도를 가지는 서로 다른 펩타이드 의 Mixture이다. 혹은 일련의 서로 다른 농도를 가지는 서로 다른 펩타이드의 경우도 마찬가지이다

 

 그러나 Promega 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix 는 6가지의 서로 다른 펩타이드를 가지며 동일한 펩타이드에 5가지 서로다른 농도의 heavy isotope이 포함되어 있다.. 즉  한번의 시료 주입으로 LC 시스템, 컬럼상태, 질량분석기의 Sensitivity와 Dynamic range 동시에 체크가 가능하다. 업체에서 소개하는 동영상에도 잘  설명되어 있다. (동영상보기)

 

Figure 1. Promega 6 × 5 LC-MS/MS Peptide Reference Mix

 

Mixture 는 DDA 보다 PRM 으로 측정하는것이 더 효과적인것 같다. 동일한 펩타이드 backbone 을 가지는 Heavy 펩타이드들은 동일한 retention time을 가진다. 그러므로  PRM 분석후 Skyline으로  쉽게 비교가 가능한다.

 

 

먼저 100 fmol를 주입하여 전체적인 피크 분포를 확인하였다.  전체적으로 피크들이 잘 분포되어 있다. 각 펩타이드들의 감도는 약간 씩 다른것 같다. 특히 첫번째 와 마지막 펩타이드는 상대적으로 낮은 감도를 가졌다.

 

1) VTSGSTSTSR, 2)LASVSVSR, 3)YVYVADVAAK, 4)VVGGLVALR, 5) LLSLGAGEFK, 6)LGFTDLFSK

 

Orbitrap Fusion 이용하여 30 peptides (6 x 5)에 대한 unscheduled PRM 분석을 해보았다. 

아래 그림은 100fmol에 대한 PRM 크로마토그램이다.

 

Figure 3. Unscheduled PRM Assay (100fmol)

Skyline 프로그램을 통해 분석해보니  5개의 서로다른 농도중 하위 2~3개는 좋은 감도로 검출되지 않았다.

농도의 범위가 10배에서 10000배 차이가 나는것을 감안하면 Unchedule PRM에서는 하위 농도 2~3개가 잘 검출이 안되는것 같다. 만약 질량분석기기의 감도가 가장 좋을때 분석하면 더 검출될수도 있을것 같다.

 

다음은 Unscheduled PRM에서 얻어진 retention time 정보를 이용하여  Scheduled PRM 으로 다시 분석하였다.

Schedule PRM에서는 전체적으로 감도가 증가하였다. 그러나 하위 농도 1~2번째 펩타이드는 잘 검출되지 않았다.

아래 그림은 VTSGSTSTSR 에 5가지 펩타이드에 대한 Skyline 그래프이다. 

 

 

 

동일양의 주입에서 scheduled PRM이 unscheduled PRM에 비해서 감도는 좋지만 매번 QC 마다 scheduled PRM를 할 수 없다 (매 분석마다 컬럼이 다를수 있다).  또한 농도의 펩타이드의 검출감도를 높이기 위해 과량의 농도를 주입하게 되면  고가의 시약이 빨리 소모될수  있다.  하지만 이론적으로 본 mixuture 는 여러가지 장점을 가지고 있으며 여러용도의 QC 에 사용될수 있을것같다.  

 

Skyline template 다운로드 

Promega_6x5_LC_mix_template.zip

0.01MB

 

찾아보니 Skyline team에서 이미 만들어 놓았다.. (바로가기)

 

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