Thermo TSQ Altis™ Triple Quadrupole 를 이용한 프로테오믹스 분석

 2018년에  microflow  Vanquish UPLC + Thermo TSQ Altis™ Triple Quadrupole 를 설치하였다. 사실 나는  MRM 분석이 주 분야가 아니다.  하지만 설치된후  특별히 테스트 할 사람이 없어서 내가 직접 몇가지 테스트를 진행했다.

 

 

 

Figure 1.  Thermo TSQ Altis™ Triple Quadrupole  coupled to   Vanquish UPLC (From Vendor website)

1) Q1 Full scan with 2 µg HeLa digest

 

먼저 대략적인 감도를 측정해보기 위해 2 µg HeLa digest를 Q1 full scan으로 분석해 보았다.  아래는 MS1 Full scan chromatogram이다.

 

 

Figure 2. Q1 Full scan of 2 µg Hela digest 

2 µg정도의 양으로 충분한 감도가 나온다는것을 확인하였다. 보통 nano LC system를 이용한 DDA 혹은 PRM 분석에서도 1~ 2 µg정도의 양이 사용되는것을 감안하면  Triple Quadrupole의 감도는 아주 좋은 편이라고 생각이 든다

 

2) MRM with 2 µg HeLa digest

 

다음은 2 µg  HeLa 로  MRM으로 분석하였다. 아래 그림에서 보듯이 아주 좋은  LC 분리능과 재현성, 그리고 검출감도를 보였다.

 

 

Figure 3. Reproducibility of MRM runs (2 µg  HeLa) 

이전의  Triple Quadrupole 에 대한 짧은 경험으로는 nano LC 시스템임에도 불구하고 MS1 full scan 감도는 그다지 좋지 않았던것 같다 (약 10년전쯤?).   하지만 Thermo TSQ Altis™ Triple Quadrupole 에서는 nano-flow가 아닌 micro LC flow system Vanquish UPLC 임에도 좋은 감도를 보였다.

 

3) Unscheduled MRM with BSA standard

 

차후 System Suitability  측정을 위해 Standard BSA를 분석하였다. 보통 nano UPLC와 연결된 Orbitrap Fusion 과 QE series에서 100 fmol 을  사용해 왔음으로 Triple Quadrupole에서는 먼저 200fmol을 주입했다. 대표적인 BSA 펩타이드를 선정후 Unscheduled MRM을 사용했다.  아래그림은  200 fmol BSA에 대한 대표적인 10개 펩타이드에 대한 MRM  크로마토그램이다.

 

Figure 4. Unscheduled MRM of 200fmol BSA

 

 

200 fmol에서 아주 좋은 감도로 검출이 되었다. 이에 따라 더 낮은 농도인 1fmol, 10fmol, 50fmol, 100fmol 에서 측정해 보았다 (Figure )

 

Figure 4.  Unscheduled MRM runs of different concentration of BSAs

 

특별히 조건을 최적화 하지 않은 상태에서 수행했는데 10fmol 정도에서도 검출이 잘되었다.  

Daily System Suitability 를 위해서 100fmol BSA를 이용한 20 min unschedule MRM로 정했다.

아래 그림은  일정기간 장비를 이후에 장비 크리닝 전후를 보여준다 (100fmol BSA, TVMENFVAFVDK)

Figure 5. System Suitability check with BSA MRM runs

 

4) Q1 and Q2 Isolation window (1.2 Da vs 0.7 Da)

 

본 시스템은 0.2 Da resolution까지 가능하다고 소개되어 있다. 아마 가장 최적화 된 상태에서의 값이 것이고 일반적인 분석에서는 가능하지 않을것이라 생각한다.  Method에서 선택할수 있는 Q1 과 Q3 resolution중 1.2 Da 과 0.7 Da 값을 이용하여 감도를 측정해 보았다.  아래 그림에서 보듯이 0.7 Da 과 1.2 Da에서 차이를 보였다.  

 

Figure 6. Comparision of Q1 and Q2 isolation windows

연구목적에 따라 Selectivity 와 Sensitivity 중 어디에 중점을 두드냐에 따라 둘중에 선택하면 될것같다. ASMS 학회 기간중 발표된 포스터를 보면 proteomics 연구에서 1.2 Da를 많이 사용하는것 같다.

하지만 Co-elution되는 펩타이드의 간섭의 영향이 크다면  0.7 Da 혹은 그 이하를 사용해야 될것이다.  

 

5) The different Retention time window for an Isolation

 

Retention time(RT)의 재현성은 MRM 혹은 PRM 과 같은 targeted assay에서 매우 중요한 요소중 하나다.

재현성이 높을 수록 Target 단백질의 RT window를 좁게 설정할수있다. 이를 통해 주어진 시간에 최대한 많은 수의 펩타이드를 분석할수있다. 아래는 BSA 펩타이드 (VPTANVSVVDLTCR)의 서로 다른 RT window 값에서 얻어진 정량값이다. 그림에서 볼수 있듯이 RT window 값이 좁아지더라도 감도의 변화에 전혀 변화가 없었다. 이것은 15초 (+, - 7초)이내의 RT 재현성을 가진다는것을 의미한다. NanoLC 시스템에서 구현하기가 어려운점이다. 

 

 

 

Figure 7. High reproducibility of Retention time

 

6) Scheduled MRM of 73 HeLa Peptides (231 transitions)

 

다음은 Hela  digestion 에서 231 transition에 해당하는 72개 펩타이드의  scheduled MRM 크로마토그램이다.  20 min LC  gradient를 이용하여 2 µg 과 4 µg 을 각 두번 분석하였다.  20 min의 짧은 분석 시간임에도 전반적으로 좋은 감도를 보였다.

 

Figure 8. Scheduled MRM of 73 HeLa Peptides (231 Transitions, 20min LC gradients)

 

7) MRM and PRM

 

2 µg HeLa에 대해 nano LC system이 연결된 QE-HFX 의 PRM 과 비교를 해보았다. 두개의  분석 방법이 다름으로 절대 비교는 할 수  없지만  MRM의  높은 selectivity와 UPLC  system의 높은 resolution로 인해 micro-flow임에도  매우 좋은 결과를 보여줬다 

 

Figure 9.  MRM and PRM runs with 2 µg  HeLa

 

  8) Unscheduled MRM of Human Plasma

 

마지막으로 high abundant protein을 제거하지 않은 human plasma 에서의 MRM 분석을 하였다.

아래그림은  0.5 µl  Human plasms 에서  234개 단백질을 분석한  MRM 크로마토그램이다.

 

 

Figure 10. Scheduled MRM runs of 234 Human Plasma Proteins

234개 단백질 모두가 잘 나온것은 아니지만 대부분의 단백질은 충분한 감도로 검출되었다.  고농도의 단백질제거 없이는 극미량으로 존재하는 혈액 단백질은 검출할수 없겠지만 대략 농도가 높은 상위 200~300개 정도의 단백질은 최적화를 통해 검출이 가능할것 같다.

 

 

결론적으로 micro-flow 의 micro LC flow system Vanquish UPLC 과 TSQ Altis™ Triple Quadrupole 의 결과에 아주 만족한다. 오래전의 Triple Quadrupole 장비에 대한 선입견이 없어졌다.  또한 Microflow LC는 nanoflow LC에 비해 몇가지 장점을 가지고 있다.  Nano LC system의 경우 분석하는 시간 외에  LC 에 소용되는 시간 (sample loading, sample trapping time) 이 상당히 많고 또한  높은 RT 재현성을 위해서는 상당한 노력이 필요하다. 또한 연속적인 시료 분석에 따라 컬럼이 손상되어 막히게 되는 경우가 종종 있다. 이에 비해  microflow에서는 이러한 단점이 현저히 줄어든다.

1)시료의 양이 충분할 경우, 2) 목표단백질이 극단적으로 낮은 농도가 아닐경우, 3)표적 펩타이드에 대한 synthetic peptide가 존재할 경우  기존의 nano LC system을 이용한 PRM 분석에 비해  확실히 장점이 있을 것 같다.