Spike-in Proteins for quantitative proteomics (Ovalbumin)

Human species 시료에 대한 Spike-in Ovalbumin 

 

Spike-in 단백질은 분석할 시료의 수가 많은 정량분석에서 유용하게 사용됩니다.   각각의 시료 전처리에 대한 재현성 여부,  각 시료분석 과정에서의 이상여부 확인,  분석후 통계처리시 표준화 (normalization)등에 사용할수 있습니다.

 

최근 PRM 혹은 DIA등을 이용한 대량의 정량분석법이 널리 이용됨에 따라  정량분석의 정확도 여부가 중요한 요소가 되고 있습니다.

 

분석의뢰자의 시료의 종은 대부분의 인간유래 종 (Homo Sapiens) 입니다. 그래서 Human 시료에 spiking 할수 있는 적절한 단백질을 찾아 테스트 해보았습니다. 아래 단백질은 대표적으로 human samples에 사용될수 있는 spike-in 단백질입니다. 모두 huam species와 sequence가 겹치는것이 없는 단백질이다.

 

- P00330 Alcohol dehydrogenase I (yeast)

- P00924 Enolase 1 (yeast)

- P01012 Ovalbumin (chicken)

 

 

대부분 가격이 저렴하고 쉽게 구매가 가능합니다.. 이 중에  Ovalbumin을 선택하고 테스트해보았습니다.

Ovalbumin 는 Sigma-Adrich에서 구매하였습니다.  (1 g당 약 65불)

 

Ovalbumin은 아래의 sequence를 가진다  

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>sp|P01012|OVAL_CHICK Ovalbumin OS=Gallus gallus OX=9031 GN=SERPINB14 PE=1 SV=2
MGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRF
DKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQ
CVKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIV
FKGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTM
SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMA
MGITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFR
ADHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP

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ovalbumin.fasta

0.00MB

 

1) Ovalbumin DDA 분석

Ovalbumin에서 대표적인 펩타이드를 선택하기 위해  100ng Ovalbumin 을 DDA로 분석후 DB 검색을 하여 약 85% 의 sequence coverage를 얻었습니다.

 

 

Figure 1. Base-peak chromatogram of 100ng Ovalbumin digest

 

Figure 2. Identified ovalbumin peptides 

 

검출된 펩타이드중에서 서로 다른 Retention time을 가지는 감도 높은 6개의 펩타이드를 차후 표적 펩타이드로 선정하였습니다.

 

Table 1. Representative Ovalbumin peptides

Ovalbumin_6peptides.xlsx

0.01MB

 

 

 

2) Ovalbumin의 Spike-in양 결정

 

Spike -in 단백질은 분석시료 분석에 방해를 주지 않을 정도의 양을 첨가하되 너무 소량을 넣게 되면 측정이 어렵게 됩니다.   적절한 양을 선정하기 위해서  1ug  HeLa  당 10, 100, 200ng ovalbumin을 첨가하여 사전 선정한 6개  Ovalbumin펩타이드에 대해 PRM 을 수행하였습니다.  아래 Skyline로 분석한 그래프에서 보듯이 10ng, 100ng, 200ng 에서 높은 감도로 재현성 있게  검출되었습니다.

 

 

Figure 3. PRM analysis of  1ug HeLa with the spiking of 10ng, 100ng and 200ng ovalbumin

아래의   1ug HeLa 당 10ng 의 Ovalbumin을 첨가했을때 얻어지는 Base-peak chromatogram (위) 와 6개 Ovalbumin peptide의 XIC 를 보여줍니다.

 

 

Figure 4. Base-peak chromatogram of 1ug HeLa with the spiking of 10ng ovalbumin

 

 

Figure 5. XIC of 6 ovalbumin peptides in 1ug HeLa digest

 

결과를 통해서 1ug 시료 (whole lysate)당 약 10ng ovalbumin 이면 spiking 양으로 적절한 것 같다. 그러나 시료 자체의 complexity에 따라 충분히 조절이 가능할것입니다.

 

마지막으로 1ug HeLa digest 에 10ng ovalbumin을 첨가한후 Label-free quantitation(LFQ) 방법으로 ovalbumin 단백질의 정량값을 측정하였습니다.  아래는 3번 반복에서 얻어진 정량값입니다.  15% CV 값으로 검출되었습니다.

 

 

 

Figure 6. LFQ measurement of 10ng Ovalbumin in 1ug HeLa digest (triplicates)