P-2000 Laser-Based Micropipette Puller 로 Nano column 만들기

대형회사가 아니면 보통 실험실에서는 컬럼을 만들어 사용한다.  

처음 일을 시작할때  실험실에 Laser puller가 있었는데 아무도 사용하지 않고 있어서 조금 의아해 했다.

다른 휴대용 가스토치로  직접 만들어 사용하고 있었다.  Vanderbilt University에 있었을때 이 laser puller를 사용했기에 그냥 쉽게 사용할 수 있었다.

 

Figure 1. P-2000 Laser-Based Micropipette Puller

https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html

 

Laser puller로 만든 컬럼이라도 항상 좋은 피크모양을 보장하지 않는다.  특히 C18을 충진하는 과정에서 비일괄적으로 충진되는 경우가 종종 있다. 그래서 같은 protocol을 사용하더라도 충진되는 시간도 다르고 LC에 연결했을때 backpressure도 다르다.  보통 사용하는 프로그램 값은 아래와 같다. 

 

아래 프로그램은 fused silica tubing의 표면을 Flame으로 제거한 후 에 사용할때 프로그램이다.

아래 프로그램은 fused silica tubing의 표면을 제거하지 않고 바로 사용할때의 프로그램이다.

 

 

 

보통 충진을 시작할때 빠른속도로 충진되는것을 선호한다.  만약 중간에 멈추거나 시간이 많이 걸린후 충진이 된 컬럼은 backpressure가 높거나 peak모양이 좋지 않을 경우가 많다.  만약 컬럼충진 Bomb에 컬럼을 장착하고 Gas를 틀면 용매와 함께 C18이 바로 충진된다. 하지만 만약 아무런 반응이 없는 경우는 Tip 끝이 Open이 되지 않은 경우가 많다. 이럴때는 아래와 같이 컬럼 절단용 툴을 이용하여 Tip의 끝의 옆면을 아주 살짝 긁어주면 막힌 tip 끝이 열리는 경우가 있다. 살짝 긁었을때 바로 용매와 함께 C18이 충진되면 성공한것이다. 하지만 Tip 끝이 상하지 않도록 아주 살짝 터치하는것이 요령이다. 그렇지 않으면 오히려 Tip 끝이 상하게 되어 못쓰게 된다

충전한 컬럼은 LC에 정착하여 추가적으로 압력을 주어 C18이 더 고르게 충진될수 있도록 한다. 이때 압력을 체크하면 컬럼의 상태를 간접적으로 알 수 있다. 만약 평소의 Flow-rate에서 압력이 너무 높거나 낮은 경우 컬럼에 문제가 있다는 것이다 (모든 연결이 정상적으로 된 경우에 한해서).  나의 경우는 troubleshooting것에 많은 시간을 허비하지 않기 위해서 나름대로 기준을 정하고 그 기준에 맞지 않으면 아예 버린다.  모든 과정이 아주 유연하게 진행되면  피크모양이 좋을 가능성이 높고 오래 사용할 수 있다. 그러므로 좋지 않은 컬럼에 Troubleshooting 시간을 허비하지 않을려고 한다. 

아래는 모든 과정이 순조롭게 되어 좋은 컬럼이 만들어진 예이다.  100fmol BSA를 Easy nLC 1000 (60min gradient)로 분석한것이다.  이정도의 피크모양이면 굳이 고가의 컬럼을 구매할 필요는 없을 것이다. 

 

 

Figure 2. BSA Chromatogram.  laser-pulled column, 75 um x 30cm,  C18, 3um, 

 

컬럼을 충진만 해놓고 체크를 하지 않은 상태에서 분석할 시료가 생기면 LC에 연결해서 체크를 하는 경우가 있다.

하지만 컬럼을 연결해서 표준시료를 분석하면 피크모양이 좋지 않아서 반복적으로 컬럼을 테스트 하느라 오전 시간을 다 보내는 경우가 있다.   장비가 운용되지 않을때 수시로 새로 충진한 컬럼을 연결하여 간단히 테스트 하여  좋은것과 버려야 할것을 구분해 놓는 습관을 들이는면 좋을것같다. 만약 질량분석기를 돌릴수 없고 LC만이라고 잠시 사용할 수 있으면 backpressure만이라고 체크해서 압력이 비이상적으로 높은것은 그냥 버리는것이 차후에 시간을 아낄수 있는 방법이라 생각한다.

 

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