Trap-column 상태확인하는 방법 (Checking efficiency of trap-columns)

Nano analytical column은 보통 실험실에서 in-house 형태로 만들어 사용하지만  상황에 따라서는 미리 만들어진 Trap-column을 구매해서 사용하는 경우도 많습니다.  실험실에서 만들어 쓰는 trap-column의 경우는 주기적으로 교체하면 됩니다. 하지만 주문하여 구입한 trap-column은 고가임으로 쉽게 버리지 못합니다. 최대한 많이 사용하되  컬럼교체 시기를 제대로 알수 있다면  컬럼 이상에 의한 실험이 잘못되는 것을 예방할 수 있습니다. Analytical column에 비해서 Trap-column은 피크모양에 상대적으로 적은 영향을  미칩니다. 그래서 피크모양으로 trap-column의 상태를 판단하기는 어렵습니다.  하하지만 Trap-column의 상태가 좋지 않으면 binding efficiency가 떨어지게 됨으로 피크의 높이가 전에 비해서 떨어지는 경향이 있습니다. 이것 또한  autosampler에서의 시료주입의 의한 문제와 구별하기가 어렵습니다.

 

시간이 지남에 딸 Trap-column의 효율성이 떨어지게 되며 제일 먼저 hydrophilic 펩타이드와의 결합력이 떨어집니다. Hyrophilic 펩타이드를 잡고 있을만한 힘을 잃게됩니다. 하지만 상대적으로 hydrophobic 펩타이드의 경우 여전히 강한 상호작용으로 인해 큰 문제를 보이지 않습니다. 즉  이전과 동일한 양의 standard를 주입했음에도  hydropilic 펩타이드들만이 상대적으로 낮은 감도를 보이면 trap-column의 상태를 의심해봐야 합니다. 

 

 Easy nLC 1000에 장착하여 사용하던 trap-column은  Acclaim™ PepMap™ 100 C18 trap-column 의 예입니다. 

아래 그림은 동일한 시스템에서 오래된것과 새로운 trap-column으로 분석한 BSA 크로마트그램입니다. 전반적으로 동일한 패턴의 크로마토그램이 얻어졌습니다. 하지만 일찍 용리되는 hydrophilic 펩타이드의 감도가 오래 사용한 컬럼에서 현저히 낮은 감도를 보입니다 (2E5 vs 1E8). 약 1000배 차이입니다. 하지만 다른 피크들의 경우 감도는 두 컬럼에서 유사합니다.  오래 사용한 컬럼의 결합력이 떨어지기 시작하는 시점입니다.  

 

 

Figure 1. BSA XIC with an old trap-column

 

Figure  2. BSA XIC with a new trap-column

다음 그림은  결합력이이  떨어진 trap-column으로  Human plamsma를 분석한 크로마토그램입니다.  아래 그림과 같이 상태가 좋지 않은 trap-column을 사용했을 때 앞쪽의 피크들이 상당히 손실된것을 볼 수 있었다. 이것은 시료주입에서 발생한것이 아니라 (만약 시료주입과정에서 발생한 문제라면 전체적인 피크의 감도가 줄어들어야합니다) trap-column 에서 선택적으로 손실이 일어난것입니다.  정상의 trap-column과 비교하지 않았다면 아마 인지하지 못하고 계속 분석을 했을것이다. 

 

Figure 3. Chromatograms of human plasma with new (upper) and old (bottom) trap-column

물론 DB 검색을 통한 단백질 정성분석에서 큰 문제가 없을 것입니다. 여전히 hydrophilic 펩타이드는 검출이 될 것입니다. 하지만 Intensity를 비교하는 label-free와 같은 절량분석에서는 큰 bias가 있을것이며 또한 hydrophilic한 phosphopeptides 분석시 큰 문제가 될 수 있을 것입니다. 

 

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