질량분석기로 단백질-단백질 상호작용 검출 (Protein-Protein interaction analysis)하기

질량분석기는 아마 특정 단백질에 상호작용하여 결합하는 단백질을 찾아내는데 있어서 가장 적합한 장비일것입니다. 최근의 질량분석기는 높은 감도와 검출속도의 덕분에 이전에 비해 훨등히 많은 단백질을 검출해 낼 수 있습니다. 

 

 

하지만 이 단백질-단백질 상호작용의 분석 실험에서 주의 해야할 사항인  비특이적( Non-specific bound proteins)으로 결합하는 단백질을 최소화 하는것입니다. 이것은 질량분석기로 검출하기전 실험단계 즉 IP/Pull-down 과정에서 이루어 져야합니다. 하지만 이러한 비특이적인 결합은 완전이 제외시킬수는 없습니다. 즉 질량분석기로 분석을 하여 얻은 단백질에는 이러한 비특이적인 단백질이 포함되어 있기 마련입니다.  종종 질량분석기에서 검출된 모든 단백질을 특이적 단백질이라 생각하여 본인의 데이타에 모두 삽입하는 경우를 본적이 있습니다.  이러한 오류를 범하지 않기 위해서  반드시 negative control 절차를 동시에 수행해야 합니다.  이렇게 할 경우 검출된 모든 단백질에서 negative control에서도 검출된 단백질은 제외 시키게 됩니다.  가능하면 3번 이상의 반복하여 일관성 있게 검출되는 단백질만을 선택해야 된다.

 

 

SDS-PAGE Runs

분석과정은 IP 실험과정과 유사합니다.  단 SDS-PAGE를 수행하는데 있어서 대표적으로 두가지 방법이 있다.

첫번째는 일반적인  SDS-PAGE 수행방법처럼  SDS-PAGE를 끝까지 내리는것이며 두번째는 짧은 시간동안만 수행하여 gel well 아래 약 0.5 cm 이내에서 멈추는것입니다 (Figure 1).

 

Figure 1. Identification of  Partner proteins

 

첫번째 방법을 사용할 경우  positive와 negative의  전체 밴드 양상을 서로 비교하면서 확인 할 수  있습니다.  또한 positive 에서만 특이적으로 생성된 밴드만을 선택적으로 절단 하여 분석 할 수 있습니다. 실험에서   Antibody 의 heavy / light chain  혹은 bait 단백질이 같이 elution 되는 경우에 이들의 단백질과 분리할수 있습니다. 아래 그림은 Heavy and light chain bands 사이에 존재하는 표적단백질의 밴드 이미지입니다. 만약 분리없이 진행하였다면 Antibody의 heavy 와 light이 시료와 같이 존재하게 되어 분석이 까다롭게 된다.

 

 

 

 

 

 

 

 

두번째 방법의 경우 단일 밴드 처럼 전처리하여 동정하면 됩니다.  특별히 단백질 검출에 있어서 문제될만한 단백질이 포함되지 않을 경우에만 사용됩니다. 고감도 질량분석기를 이용하면 다 질량분석기로 분석하더라도 큰 어려움없이 대부분의 단백질을 검출 할 수 있습니다.  두 방법중 어느 방법을 쓰던지  Negative와 Positive를 동시에 분석해서 비교하게 되면  positive 단백질만 선택적으로 골라낼수 있다.  종종  멋진 단백질이 Positive와 Negative 에 동시에 나올때가 있다. 이럴때는  멋진 단백질을  목표단백질 리스트에 포함시키고 싶은 유혹을 받게 되기도 한다.