Immunoprecipitation 이후 질량분석을 위한 시료 전처리 방법 (Sample preparation of IP elution for MS analysis)

IP이후 단백질 분석을 위해서는 얼마만큼의 양이 필요한가?

 

(Co)-Immunoprecipitation (IP) 혹은 Pull-down 이후 질량분기를 통한 단백질 분석은 특정 단백질을 검출하는 방법중 가장 감도가 높은것중에 하나입니다.    이 실험의 성공여부는 질량분석전 특정 단백질을 얼마나 순수하게 잘 정제하느냐가 관건입니다.  이 부분은 IP/Pull-down을 수행하는 사람이 최적화를 할 수 밖에 없습니다.

 

 

이 이후 질량분석기로 분석하기 전에 가장 많이 받는 질문이 " 필요한 양" 입니다.  간단히 말하자면 "많을 수록 좋다(The more, the better)" 입니다.   하지만 의뢰자는  보다 정확하게 알기를 원합니다.

 

그러나 IP 수행후 Elution buffer 안의 단백질 양을 정확히 알기가 어렵습니다.  기존에 늘 해오던 실험의 경우 경험에 의해 대략의 양을 예상 할 수 있지만 새로운 단백질과 새로운 Antibody를 사용 할 경우 예상하기가 어렵습니다.  일반적으로 의뢰자와 의견이 맞지 않는 부분중 하나가 시료의 양입니다. 의뢰자는 충분히 양이 많을 것이라고 예상하지만 검출해보기 전에는 알수가 없습니다.  그리고 막상 결과가 좋지 않을때도 시료의 양이 아니라 장비의 문제라고 여길수 있습니다.  의뢰자는 자신이 하는 실험에 최선을 다하기 때문에 실험이 잘 진행되어 충분한 양이 확보될것이라는 믿음을 가지는것은 당연합니다.

 

분석서비스는 실험결과가 좋지 않을 경우에도 장비의 문제가 확실한 원인이라고 밝혀지지 않는한 서비스료를 청구합니다.   실험과정에서 사용된 시약과 장비사용 시간이 들어갔기 때문입니다.  그러므로 분석전에 시료의 양을 서로 확인하는것은 나중에 발생한 불편함을 최소화 할 수 있습니다.  양을 확인하는 방법은 Bradford 혹은 BCA등으로 단백질 정량을 하는것이 제일 확실한 방법입니다.   만약 1ug 로 안되는 양이 회수되는데 이것을 측정하고자 Bradford나 BCA  Assay를 하게되면 모든 시료를 다 소모하게 되어 실제 분석할 양이 부족하게 됩니다.

 

SDS-PAGE runs

이러한 이유로   IP/Pull-down 시료는 반드시 SDS-PAGE를 내려서 Band의 진하기를 확인하는 절차를 거칩니다. 

이것은 두가지 목적이 있습니다.    외뢰자가 사용한 Buffer를 제거하기 위함이고 또한 Band(Coomassie dye)의 진하기를 통해 단백질의 양을 대략 예측하기 위합니다. 일반적으로 Coomassie blue 염색시 band가 최소한 눈에 보여야 됩니다.

배경색과 차이가 나지 않을 정도의  진하기라면 좋은 결과를 예상할 수 없습니다.이 경우 시료의 양을 좀더 늘려오기를 추천합니다.

 

 좋지 않은 시료를 반복해서 측정하는것 보다 좋은 시료로 한번에 원하는 결과를 얻는것이 좋습니다.  의뢰자도 필요없이 분석비용을 반복적으로 내지 않아도 됩니다.  가끔은 SDS-PAGE를 스캔하는 과정에서 band의 진하기를 높이고자 contrast를 조절하여 생성된 이미지도 있습니다.  이런 경우 의뢰자가 있는 상태에서 실제로 눈으로 확인하고 진행여부를 결정합니다.  이러한 과정을 거치게 되면 의뢰자와 최대한 비슷한 기대치를 가지게 됩니다. 차후 실험결과에 문제가 있을때 보다 쉽게 해결을 할수 있습니다.   

 

 

Figure 1. Protein Identification of IP (Pull-down) Samples

 

 

 

Standard BSA

가능할 경우 서로 다른양의  Standard BSA(e.g, 100ng, 500ng, 1ug, 2ug)를 같이 loading할것을 요청합니다.  이 경우  Target 단백질의 양을  예측하는데 많은 도움이 됩니다.  아래 그림은 한 의뢰자가 실제로 내린 BSA와 자신의 시료의 SDS-PAGE 이미지입니다. 이러한 시료의 경우  대부분은 매우 좋을 결과를 얻을수 있습니다. 혹 결과가 좋지 않을 경우 시료 자체의 문제라기 보다는 장비의 문제일 가능성이 높습니다.

 

 

Figure 2. SDS-PAGE Image including standard BSAs

 

만약 의뢰자가 standard BSA의 이미지를 확보할 수 없을 때는  차선책으로 우리가 가진 BSA standard gel를 비교용으로 보여줍니다.   물론 염색약의 종류, 염색시간에 따라 차이가 많이 나지만 그래도 어느정도 도움이 됩니다.

 

아래 그림은 서로 다른 양의 BSA 결과입니다.

BSA (Pierce, P/N 23209) . Staining time:10 min, Overnight washing

 

Figure 3. SDS-PAGE image of different BSA amounts

참고로 0.5 ug 정도의 진하기는 단백질 정성용으로 매우 적절합니다.  만약 PTM 분석이 요구될 경우 최소 3.0ug 에 해당하는 진하기를 요구합니다. 물론 그 이하도 가능하지만  첫번째 주입시 결과가 좋지 않을 경우 방법을 바꿔서 2~3번 더 시도해 볼수 있는 충분한 양이 필요하기 때문입니다.  한 예로 아래 이미지는  한 분석외뢰자가 PTM 분석을 위해서 보낸 SDS-PAGE 이미지의 일부분입니다.  이정도의 양이면 band당 5~10 ug 이상이 될것입니다.  이 밴드로 인산화(Phosphorylation) 단백질을 성공적으로 검출하였습니다.