많은 수의 human plasma 시료의 정량분석을 위한 전처리 방법

Plasma  시료전처리의 어려움

Plasma 시료 분석 의뢰는 일반 분석에 비해서 많은 수의 시료를 접수합니다.  상대적으로 채취가 쉬워서 일수도 있고 의미있는 단백질을 찾기 위해서 여러 환자로 부터 시료를 모을때 까지 기다렸다가 접수하는것이 하나의 이유가 될수 있습니다.

 

혈액시료의 특이성 때문에 전처리할때 상당한 주의가 필요합니다. 특히 환자시료에 따라 점성이 높기 때문에 파이펫 에러가 생길 가능성이 높습니다.

혈액시료는 농도가 아주 높기 때문에 (50~60ug/ul) 전처리 할때 많은 양을 사용하지 않습니다. 이러한 이유로 소량의 volume을 파이펫으로 옮기다 보면 작은 시료 손실에도 정량분석에 영향을 많이 줍니다. 파이펫으로 정확한 볼륨이 옮겨지지 않거나 혹은 파이펫 주위에 추가로 묻은 혈액으로 전체 양이 달라질수 있습니다.

 

혈액을 파이펫으로 픽업을 할때는 최대한 파이펫 팁끝이 최소한으로 닿게 해야 합니다. 또한 픽업후 직접 눈으로 파이펫에 혈액이 정상적으로 옮겨졌는지 확인을 해야 합니다. 하지만 많은 시료를 한꺼번에 처리할때는 이러한 일이 쉽지 않습니다.  또한 혈액의 경우 얼리고 녹이는 과정에서 변성이 될수 있음으로 분석전에 이러한 과정이 최소화 되어야합니다.

 

Plasma 시료 전처리를 위한 시료준비

혈액시료를 받으면서 약간의 노하우가 생겼습니다. 보통 병원에서 시료가 올때는 각각의 튜브에 담겨서 옵니다. 그리고 혈액의 양이 상당히 많을때가 있습니다. 실제 분석에는 소량만 필요하기 때문에 얼려있는 시료를 녹인후 일일이 적당량을 옮겨 담아야 합니다.  이때 많은 수의 시료를 적은 볼륨으로 하나씩 옮기다보면 에러가 생길가능성이 높습니다. 또한 진행과정에서 시간이 많이 소요되어 시료의 변성이 염려되기도 합니다.

 

Plasma 시료 접수전 의뢰자 준비사항

그래서 시료를 보내기 전에 다음과 같은 요청을 합니다.

1.모든 시료를 96-well plate에 옮겨서 보내기 

  -이것을 우리의 많은 노동력과 시간을 줄여주게 됩니다. 

2.정확히 20ul 씩 aliquote 하여 보내기-

  -이렇게 보내오면  우리쪽에서는 그 96-well plate에  multi-channel pipette으로 동일한 양의 buffer를 옮겨 dilution만 시키면 됩니다.

3.만약 정확히 20ul씩 옮길수 없는 상황이지만 볼륨이 많을 경우

  -이경우는 반대로 미리 저희쪽에서 96-well plate에 적당한 양의 buffer를 담아놓은후 시료가 오면 multi-channel pipette 로 10혹은 20ul의 혈액시료를 준비해 둔 buffer에 옮깁니다.

의뢰자 입장에서는 번거로운 작업일수 있습니다. 하지만 정확한 정량분석을 위한 것이기 때문에 의뢰자들은 흔쾌히 수긍합니다.

 

 

 

 

Plasma 시료 Tryptic Digestion

 이제 reduction, alkylation, trypsin digestion, clean-up 까지 96-well plate에서 순조롭게 진행할수 있습니다.  

 

아래 그림은 위의 3번째 경우에 해당하는 시료 전처리 방법입니다. 

 

• 먼저 96-well deep plate에 190  µL Urea buffer를  첨가합니다.
• Multi-pipette으로 10ul Plasma를 옮깁니다. 그러면 Plasma는 20배 희석됩니다. 여기서 20ul 를 취하여 Digestion 합니다. 
• Plasma의 농도는 보통 60 µg/ul라고 알려져 있습니다. 그러므로 실제 최종적으로 Digestion 되는 단백질의 양은 60 µg이 됩니다. 

아래와 같이 20배로 희석된 plasma 20 µL를 취한후 순차적으로 Reduction, Alkylation, Trypsin digestion을 96-well plate에서 수행합니다.

 

 

 

실제 질량분석에 주입되는 양은 1~2 µg 밖에 되지 않기 때문에 더 적은 Volume의 plasma를 사용해도 됩니다. 하지만 너무 작은 volume으로 시작하면 Pipette error에 의한 오류가 커질수 있습니다. 또한 더 큰 volume 을 사용하면 Digestion시 필요없이 많은 trypsin을 사용해야됩니다.  일반적인 96-well plate의   volume이 약 200ul 됨으로 trypsin digestion에 사용될 buffer의 총 volume도 고려해야 합니다.

 

 

Trypsin digestion 끝난 시료의 최종 volume은 120 µL 입니다. C18 컬럼으로  clean-up하기 위해서  actidify 시킵니다. 그리고 96-well plate   형태의  C18 을 Vacuum manifold에 장착하여  clean-up 합니다.

 

최종 elution 을 회수할때 PCR tube형태의 96-well plate를  사용합니다. 건조시킨후 바로 MS buffer로 첨가한후  autosampler 에 장착할수 있습니다.  이럴 경우 일일이 하나씩 autosampler vial에 옮길 필요가 없습니다. Dionex UPLC, Easy nLC의 경우 96-well plate를 장착하여 시료를 주입할수 있는 기능이 있습니다.

 

최종 단백질의 양이 대략 60 µg임으로 120 µL buffer를 첨가하여 4  µL를 주입하면 최종 2 µg정도가 주입됩니다. 

 

 

 

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