Short LC gradient에서 DDA 의 Top N 수 설정

 

 

 

동일한 조건에선 LC gradient 의 시간과 검출되는 펩타이드의 수는 비례합니다. 물론 일정 길이 이상으로 증가되면 새롭게 검출되는 펩타이드 수는 현저이 줄어듭니다. 분석할 시간에 제한이 없으면 최대한 LC gradient 시간을 늘여서 분석하는것이 좋겠지요.  하지만 제한된 시간안에서 최대한 많은 시료의 수를 분석해야 될 경우는 시료의 수나 LC gradient 시간 둘 중에 하나를 줄여야 됩니다. 의뢰가 들어온 시료의 수를 줄일수는 없음으로 LC gradient를 줄일수 밖에 없습니다.

 

Complex 시료의 경우 LC gradient가 줄어들게 되면 검출되는 펩타이의 수가 줄어들게 됩니다. 하지만 이것을  어느정도 보상해 줄 수 있는 방법이 있다면 좋겠습니다.  이럴때  DDA에서 높은 수의 TOP N 수를 사용하면 좋습니다.    Gradient 길이가 줄어듬에 따라 주어진 시간에 용리되는 펩타이드의 수가 증가됩니다.  또한  Gradient의 기울기가 더 급해짐으로 펩타이드 피크가 상대적으로 좋아지고 좁아지게 됩니다.

 

이 경우 높은 TOP N 을 설정하면 주어진 시간에 좋은 스페트럼으로 최대한 많은 수의 펩타이드를 얻을수 있습니다. 이것이 가능하기 위해서는 아무래도 질량분석기의 성능이 좋아야 되겠지요

 

어느정도 효과가 있는지 확인해보고자 합니다.

아래는 200 ng HeLa standar digestion에 대한 30 min와 60 min gradient에서 얻어진 크로마토그램입니다.

질량분석기 장비는 Q-Exactive HF 입니다.

 

 

 

 

30 min LC gradient에서 DDA Top 40으로 설정하였습니다.

아래는 Full scan에서 보여지는 Top 1st (m/z 367.2335) 과 Top 40th (m/z 657/8608( 피크입니다.  Top 40번째 피크는 Top 1에 비해서 Intensity가 매우 낮습니다.

 

 

 

아래는 두 펩타이드 피크에 대한 MS2 스펙트럼입니다.  아래 스펙트럼에서 보듯것과 같이 Top 1는 물론 Top 40 번째 피크도 아주 좋은 MS/MS2 스펙트럼이 얻어졌습니다.  QE-HF 의 검출 속도가 빠른것 같습니다.  이러한 속도가 지원되지 않으면 Top 40 번째 피크의 스펙트럼은 좋게 나오지 않습니다.  왜냐하면 느린 속도로 인해 Top 40까지 가는 동안 이미 이온들은 모두 다 빠져나갔기 때문입니다.

 

 

아래는 그래프는  2µg HeLa digestion 을 이용하여 30, 60min 에서 서로 다른 DDA TOP N을 사용하여 얻어진 단백질과 펩타이드의  수 입니다. 그래프에서 보듯이 LC gradient 의 길이가 긴 분석에서 많은 수가 검출되 었습니다.

 

30min gradient 에서는 Top 20, 40 보다 50에서 조금더 많은 수 가 검출되었습니다. 즉 30min 에서는 TOP 50가 효율적으로 사용되었습니다.  60min gradient에서는 Top 20 과 Top 40에서 차이가 거의 없습니다. LC gradient의 길이가 길어질수록 분리능이 증가됩니다. 그래서 주어진 시간에 용리되는 펩타이드의 수가 그만큼 감소합니다.

즉 DDA에서 TOP 40을 설정하더라도 기준값에 해당되는 펩타이의 수가 20개 이상이 생성되지 않음으로 그냥 TOP 20 이하에서 수행하는것과 동일한 효과를 가지게 됩니다.

 

비록 60 min gradient에서 많은 수가 검출되었지만 만약 시간이 더 중요한 요소로 작용한다면  30 min 에서는 검출되는 수는 적더라도 2배의 시료 수를 분석할 수 있습니다.