FAIMS 사용 시 주의할 점

CV의 수가 많다고 항상 좋은 것은 아니다

 

FAIMS method에서 가장 중요한 요소 중 하나는 CV 선택과 사용하는 CV의 개수입니다.

 

모든 peptide의 optimal CV는 다르다

Peptide마다 가장 잘 통과하는 optimal CV가 다를 수 있습니다. 예를 들어 어떤 peptide는 −40 V에서 가장 잘 검출되고, 다른 peptide는 −55 V 또는 −70 V에서 더 잘 검출될 수 있습니다. 하지만 peptide sequence만을 이용하여 각각의 정확한 optimal CV를 미리 예측하는 것은 어렵습니다. 따라서 DDA 분석에서는 모든 peptide의 optimal CV를 개별적으로 찾기보다는 몇 개의 대표적인 CV를 사용하는 경우가 많습니다.

 

예를 들어,

−40 V → −55 V → −70 V

와 같이 여러 CV를 순차적으로 사용할 수 있습니다.

다만 이러한 CV 값은 예시일 뿐이며 모든 분석에 적용되는 고정된 표준값은 아닙니다.

 

왜 여러 CV를 사용하는가?

한 개의 CV만 사용하면 그 CV 조건에서 잘 통과하는 peptide는 효과적으로 검출할 수 있지만, 다른 CV에서 더 잘 통과하는 peptide는 놓칠 수 있습니다. 반대로 여러 CV를 사용하면 서로 다른 mobility 특성을 가진 더 다양한 peptide를 관찰할 수 있습니다.

하지만 여기에는 단점도 있습니다. 여러 CV를 순차적으로 사용하면 전체 acquisition 시간이 각각의 CV에 나누어집니다. 따라서 하나의 peptide를 측정할 수 있는 기회가 감소할 수 있습니다.

 

Data point 감소 문제

예를 들어 하나의 chromatographic peak가 15초 동안 나타난다고 가정해봅시다. CV 하나를 사용한다면 같은 CV 조건에서 계속 peptide를 측정할 수 있습니다. 반면 여러 개의 CV를 사용하면 CV가 반복적으로 변경되면서 acquisition 시간이 나누어집니다.

그 결과 하나의 chromatographic peak에서 얻을 수 있는 data point 수가 감소할 수 있습니다. 이것은 특히 정량 분석에서 중요합니다. Peak area를 정확하게 계산하려면 chromatographic peak 전체에 걸쳐 충분한 수의 data point를 확보하는 것이 필요하기 때문입니다.

 

 따라서 FAIMS에는 다음과 같은 trade-off가 존재합니다.

CV 수 증가 → 더 다양한 peptide를 검출할 가능성 증가

CV 수 증가 → peptide당 data point 감소 가능성 증가

즉, CV가 많다고 항상 좋은 것은 아닙니다.

 

짧은 LC gradient에서는 더 주의해야 한다

짧은 LC gradient에서는 짧은 시간 동안 많은 peptide가 함께 용리됩니다. 질량분석기는 이미 많은 precursor를 제한된 시간 안에 분석해야 하기 때문에 acquisition cycle이 바빠집니다. 이 상황에서 많은 CV를 사용하면 각각의 peptide를 측정할 수 있는 기회가 더욱 줄어들 수 있습니다. 따라서 짧은 LC gradient에서는 CV의 수를 줄이는 것이 유리한 경우가 있으며, 상대적으로 긴 gradient에서는 여러 CV를 사용할 수 있는 여유가 커집니다. 하지만 “짧은 gradient에서는 CV 1개, 긴 gradient에서는 CV 3개”와 같이 정해진 규칙이 있는 것은 아닙니다. 적절한 CV의 수는 LC gradient, chromatographic peak width, sample complexity, MS scan speed, sample amount와 분석 목적 등을 고려하여 결정해야 합니다.

 

PRM에서는 optimal CV가 중요하다

DDA와 달리 PRM에서는 미리 정해진 target peptide를 높은 감도와 재현성으로 측정하는 것이 목적입니다.

따라서 PRM에서는 가능하면 각각의 target peptide에 적합한 optimal CV를 확인하는 것이 좋습니다.

가장 확실한 방법 중 하나는 synthetic peptide를 이용하여 여러 CV 조건에서 실제로 측정해 보는 것입니다.

Synthetic peptide를 이용한 최적화가 어려운 경우에는 이전에 수행한 FAIMS-DDA 결과에서 target peptide가 어느 CV에서 가장 잘 검출되었는지를 참고할 수도 있습니다.

 

PRM target이 많으면 문제가 될 수 있다

Target peptide가 많지 않다면 각 peptide에 서로 다른 CV를 사용하는 것이 큰 문제가 되지 않을 수 있습니다.

하지만 같은 retention time 부근에 많은 target peptide가 존재하고 각각 서로 다른 CV를 필요로 한다면 전체 cycle time이 길어질 수 있습니다.

예를 들어,

Peptide A → −40 V

Peptide B → −50 V

Peptide C → −60 V

Peptide D → −70 V

와 같이 여러 peptide가 서로 다른 CV를 필요로 한다면 질량분석기는 CV를 변경하면서 각각의 PRM scan을 수행해야 합니다.

그 결과 하나의 chromatographic peak에서 얻을 수 있는 data point 수가 감소할 수 있습니다.

 

특히 낮은 농도의 peptide는 충분한 ion을 모으기 위해 injection time이 길어질 수 있으므로 이러한 문제가 더욱 커질 수 있습니다.

따라서 FAIMS-PRM method를 만들 때는 단순히 각각의 peptide에 가장 좋은 CV를 찾는 것뿐 아니라 다음 요소들을 함께 고려해야 합니다.

CV 수 + target 수 + retention time + cycle time + data point 수

 

정리

FAIMS는 매우 유용한 장치이지만 단순히 사용한다고 해서 항상 더 좋은 결과를 얻을 수 있는 것은 아닙니다. 적절한 CV를 사용하면 background와 interference를 줄여 낮은 abundance의 peptide를 더 잘 검출할 수 있습니다. 반면 너무 많은 CV를 사용하면 acquisition 시간이 여러 CV에 분산되어 각각의 peptide에서 얻을 수 있는 data point가 감소할 수 있습니다. 결국 FAIMS를 효과적으로 사용하기 위해서는 다음 두 가지 사이에서 적절한 균형을 찾는 것이 중요합니다. 더 다양한 peptide를 선택적으로 검출하는 것. 각 peptide를 충분한 횟수로 측정하는 것  이 두 가지 사이의 균형을 맞추는 것이 FAIMS method optimization의 핵심입니다.