Longer peptide fragmentation with HCD, ETD, and EThcD

 

 

 

가끔씩 아주 긴 펩타이드를 검출해야 될 때가 있습니다.  bottom-up과 top-down 의 중간정도인 middle-down 분석이라 할 수 있습니다.  Trypsin으로 단백질을 절단할때 가끔씩 Lysine과 Agrinine의 분포도가 적어서 아주 긴 펩타이드가 생성되기도 합니다. 또한 원하는 펩타이드의 조각을 얻기 위해서 trypsin이 아닌 다른 enzyme을 사용해야 될때가 있는데 이때도 가끔 긴 펩타이드가 생성됩니다. Histone의 경우 Molecular weight이 작은 뿐더러 Lysine과 Arginine이 많이 분포되어 있어서 trypsin으로 절단하게 되면 LC-MS/MS에 적절한 길이가 생성되지 않습니다. 이러한 이유로 Glu-C 와같은 enzyme을 사용하게 됩니다. 이때 아주 긴 펩타이드가 생성되어 middle-down 형태의 분석이 됩니다.

 

 

ETD는 높은 전하를 가지는 긴 펩타이드에 유용하다고 합니다. 또한 PTM 분석에도 유용합니다.

그래서 HCD와 ETD를 사용하여 길이가 긴 펩타이드 분석을 비교해 보았습니다.

 

시료는  Human H2A standard 와 calf Thymus Histone standad mixture를 사용하였으며 Glu-C를 이용하여 절단하였습니다.

 

아래는 LNKLLGRVTIAQGGVLPNIQAVLLPKKTE  (Charge: +4,   Monoisotopic m/z: 771.72442 Da) 에 대한 HCD MS2 스펙트럼입니다. 긴 펩타이드인 만큼 HCD에서 많은 Product ion들이 보입니다.

 

 

동일한 펩타이드에 대한 ETD 스펙트럼은 아래와 같습니다. Orbitrap Fusion의 경우 기존의 ETD에 추가적인 옵션을 선택할 수 있습니다.  Supplemental collision Energy type을 EThcD로 설정하고 두개의 SA Collision Energy 값 (15, 25)를 사용하였습니다.

 

아래는 ETD only, EThcD (15 %),EThcD(25%)에 대한 스펙트럼입니다.  ETD only에서는 Precursor ion이 거의 fragmentation되지 않았고 EThcD에서는 25%에서 상대적으로 많은 fragmentation이 보입니다.  ETD의 단점중 하나인 precursor ion이 MS2 스펙트럼에 상당한 intensity로 남아있는 점을 확인할 수 있습니다.

 

 

 

아래는 Proteome discoverer를 통해 matching 된 스펙트럼입니다.

두 개 모두 잘 검색이 된것같습니다.

 

이외 다른 펩타이드들로 두 mode에서 잘 검색이 되었습니다. 아래는 그 예입니다.

TAPVAPAAPAPAEKTPVKKKAKKSGVAAGKRKASGPPVSE, 647.2114, 6+ H1,3

 

 

TAPVAPAAPAPAEKTPVKKKAKKSGVAAGKRKASGPPVSE, 649.5476, 6+ H1,3

 

두개의 lysine에 methylation이 된 형태의 긴 펩타이드의 경우 HCD mode에서만 검출이 되었습니다.

 

Human H2A standard 분석에서 전반적으로 HCD에서  PTM 펩타이드를 더 많이 검출되었습니다.

사실 ETD가 긴 펩타이드의 PTM 검출에  더 좋을것이라 예상했지만 이번 실험에서는 그다지 좋은 결과를 얻지 못했습니다. 아직 ETD 분석에 익숙치 않아서 최적화가 안되었기 때문일 수 도 있을것 같습니다. 하지만 HCD만으로도 충분히 긴 펩타이드를 잘 검출 할 수 있음을 확인하였습니다. 두 mode를 적절히 배합해서 사용하면 좋을것 같습니다.

 

 

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