[Biognosys spectronaut] DIA normalization Setting (Ovalbumin DIA 정량분석)

이전글에 TMT 분석에서 MS2 와 MS3의 정량성과 Label-free quantitation의 정량성에 대한  실험을 했었습니다.   

이전글) TMT 정량의 분석에서의 SPS MS3 방법은 진짜 좋은가?

 

동일한 시료를 이용하여 DIA 분석을 통해 TMT 분석과의 정량성 차이를 보고자 하였습니다. 또한 Biognosys사의 Spectroanut에서 몇가지 normalization  옵션을 비교해 보았습니다. 

 

 

2.5ng, 25ng, 50ng의 Ovalbumin을 동일한 양의 HeLa digest에 Spiking 하여 DIA를 분석하였습니다. 장비는 Easy nLC 1000 과 Q-Exactive 입니다.

 

3번 반복실험후 Biognosys 사의 Spectronaunt  프로그램을 이용하여 정량분석을 하였습니다.

Spectroanut로 분석시 default 값을 사용하였습니다.  각각의 Ovalbumin의 농도에서 검출된 정량분석값은  아래와 같습니다.  전반적으로 이론적인 값과 유사하지만 25ng과 50ng에서 재현성이 약간 떨어지는것 같습니다. 

Group으로 묶어서 그래프를 그리면 조금더 좋아보이기는 합니다.  TMT의 MS2에 비해서는 조금 더 정확한 정량성을 보입니다.

검출된 Ovalbumin의 펩타이드의 정량값은 아래와 같습니다. 많은 펩타이드들이 Filtered 되었습니다. 검출이 안된것일수도 있고 Quality가 좋지 않아서 정량값에서 제외된것일 수도 있습니다. 단백질의 정량분석시 펩타이드중에 Filtered값이 많이 포함된다면 아마 정량성이 떨어질것 같습니다.

 

 

Spectronaunt Normalization Setting

Biognosys 담당자와 간단한 의견교환후 Spectronaunt 분석시 normalization 옵션을 바꾸어 보기로 하였습니다. 

Spectronaunt Manual에는 아래와 같이 설명되어 있습니다. 

 

 

아래 그림은 Default 로 사용되는 Global Normalization입니다. 

 

업체측의 조언대로 아래와 같이 Global Normalization을 off 한후 아래 그림과 같이 Qvaule, Qvaule_Sparase, Qvalue_Complete로 분석해보기로 하였습니다. 

 

 

Peptide List with different Normalization Settings

각각에서 얻어진 펩타이드 리스트는 아래와 같습니다. 

 

Qvaule

  

Qvaule_Sparase 

Qvalue_Complete

 

각각의 옵션에 따라 검출된 펩타이드의 종류, Filtered 펩타이드의 종류가 차이가 납니다.  흥미로운것은  Qvalue Complete에서는 Filtered 값이 포함된것은 모두 제외되었습니다. 

 

 

Relative Abundance of Ovalbumin with different Normalization Settings

아래는 4가지의 옵션에서 얻어진 Ovalbumin의 상대적인 정량값에 대한 그래프입니다 (개별 그래프와 그룹 그래프).

 

 

매뉴얼에도 적혀있듯이 Qvalue filtering 의 stringent가 다릅니다. 그러므로 각각의 옵션에  따라 filtering 되는 기준이 다르기 때문에 실험의 목적에 따라 적절히  사용해야 될것 같습니다. 

 

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