LC troubleshooting) 갑자기 펩타이드가 빨리 혹은 늦게 용리되는 이유

한의원을 가면 손목이 아픈데 침은 목이나 팔위에 놓을때가 있습니다.  손이 저리거나 통증이 있으면 물리치료사는 목이나 어깨를 교정하는 경우가 있습니다. 원인과 결과를 차이를 보여주는 사례인것 같습니다.  

 

Nano-LC에서도 여러 이상 현상이 일어납니다. 이때 일어나는 결과를 보고 원인을 해결해야 합니다.  비정상적인 크로마토그램이 보인다면 근본 원인을 찾아서 해결을 해야 합니다. 장비에 익숙한 연구자에게는 어려운일이 아닙니다. 하지만 초보자들은 이러한 문제가 생겼을때 어떻게 조치를 해야 되는지 잘 모르는 경우가 있습니다.  그래서 필요없는 조치를 하느라 시간을 보내는 경우가 많고 또한 더 문제를 발생케 하는 경우가 종종있습니다. 시스템의 문제임에도 시료의 의 문제라고 판단하는 경우가 있으며 반대로 시료의 문제인데 시스템의 문제라고 생각하는 경우가 있습니다.  

 

 

 

 

1. 정상적인 크로마토그램보다 전체적으로 늦게 용리된다.

 왜 크로마토그램이 전체적으로 늦게 용리될까요? 컬럼의 길이가 갑자기 길어진것도 아닐것입니다. 늦게 용리되었다는것은 원리적으로 펩타이드가 컬럼의 C18에 오래머물렀다는 것입니다.컬럼 이전의 연결선(튜빙)은  빈 공간이기 때문에 펩타이드가 오래 머물수가 없습니다. 즉 펩타이드가 컬럼의 C18에 오래 머물게 되는 이유를 찾아야 됩니다. 펩타이드가 C18에 오래 머물게 되는 가장 큰 이유중는 펩타이드가 매우 hydrophobic한 경우 입니다. 하지만 동일한 시료를 분석하는 과정에서 시료의 성질이 바뀔수가 없지요. 즉 외부적인 영향에 의해서 발생하게 됩니다.  펩타이드가 C18에서 빨리 용리되지 못하는 만드는 이유중 하나가 Buffer B (유기용매)의 비율이 줄어든 경우입니다.  그렇다면 무슨 원인으로 Buffer B의 비율이 줄어들까요?  동일한 LC gradient 조건을 사용했기 때문에 LC gradient의 기울이가 변경된것은 아닐것입니다. 

 

Buffer B의 leaking으로 인해 이론적인 비율보다 낮은 비율로 용매가 컬럼으로 들어간것이라고 예상할수 있습니다. 시스템에서 특정 비율의 Buffer B를 흘러보내지만 컬럼에 도착하는 과정에서 손실이 생겨서 결국 컬럼에서는 낮은 비율의 Buffer B가 흘러간 경우입니다.   또 다른 경우는 Buffer B 라인이 어느정도 막혀서 충분한 Buffer B가 흘러가지 못할수 도 있습니다. Nano-LC의 경우 flow-sensor가 장착되어서 flow-rate를 조절합니다. 그러므로 막힌곳이 생기면 sensor가 정상적으로 작동하지 않아서 이론적인 flow-rate값으로 작동하지 않는 경우가 있습니다. 즉 Buffer B에 관련된 line에서 원인을 찾아야 합니다.

 

증상이 심할경우 정상적인 압력에 비해서 매우 낮거나(leaking) 혹은 매우 높거나 (clogging) 할수 있지만 증상이 심하지 않을 경우 잘 모를수가 있습니다.  피크의 모양이 나쁘지 않은 상태에서 늦게 용리된다면 컬럼의 C18의 문제는 아닐것입니다. C18 자체가 문제라면 피크의 모양이 나빠져야 합니다.  즉 피크의 모양이 정상이라면 컬럼을 바꿀 필요는 없습니다.

 

 

2.정상적인 크로마토그램보다 전체적으로 빨리 용리된다.

앞의 경우와 반대 경우가 됩니다. 컬럼의 길이가 갑자기 짧아지지 않았는데 펩타이드가 평소보다 빨리 용리되는 경우가 있습니다. 위에서 설명한것과 같이 어떤한 이유로 Buffer A의 비율이 낮아져서 상대적으로 Buffer B의 비율이 높아졌기 때문일수 있습니다.   증가된 Buffer B의 비율로 인해 빨리 용리되는 경우가 있습니다.  이 경우 빨리 용리되는것과 더불어 피크의 모양이 더 좋아지는 경우가 있습니다. 높은 비율의 Buffer B로 펩타이드를 밀어주기 때문입니다. 즉 Buffer A에 관련된 line에서 원인을 찾아야 합니다.

 

Flow-rate 체크하기

한가지 더 생각해야 될것은 flow-rate입니다. Buffer A 나  B 의 leaking등으로 인해 이론적인 flow-rate보다 낮은 flow-rate이 형성될수 있습니다. 이 경우 피크들이 약간 밀려서 늦게 용리될수 있습니다.  nano-flow rate은 육안으로 정확히 체크하기는 불가능합니다. 하지만 간접적으로 체크는 할 수 있습니다.  컬럼에 연결된 voltage를 끈 상태에서 컬럼의 tip에서 용매가 정상적으로 흘러나오는지 체크를 합니다. Voltage를 끈 상태에서 용매를 흘러주면 컬럼 Tip끝에서 용매방울이 형성됩니다. 만약 일반적인 경우보다 방울이 형성되는 크기가 작다면 정상적인 flow-rate이 아닐수 있습니다. 평소에 방울크기에 대한 감이 있어야 합니다. 즉 위에서 설명하였듯이 어느 지점에서의  leaking이나 clogging으로 인해 정상적인 양의 용매가 나오지 않을수 있습니다. 

 

종종 컬럼 tip 끝이 막히는 경우가 있습니다. C18 materials이나 다른 이물질들이 컬럼 tip을 막고 있는 경우입니다.  용매를 흘려주되 Voltage를 끈 상태에서 라이터불로 tip에 살짝만 갖다 대었다가 빼면 (약 0.5초) 막힌것이 해결 될수 있습니다. 열로 인해 Tip 끝이 열리게 되고 막힌것들이 빠져나가는 경우가 있습니다. 이때 압력이 떨어지면서 tip 끝이 큰 방울이 맺히게 됩니다.

 

 

 

 

위의 설명은 문제를 해결하기 위한 조차방법을 설명하는것이 아닙니다.  문제가 생겼을때 논리적으로 접근해서 이유를 찾아야합니다.  Leaking된 지점과 clogging 지점을 찾는것은 또 다른 기술이 필요합니다.