FAIMS를 이용한 DIA분석에서 고려해야 될것들

DIA의 목적은 분획하지 않고 최대한 많은 단백질/펩타이드를 검출하는것과 더불와 높은 정량성을 얻기 위함입니다. 그러므로 FAIMS를 이용한 DIA분석조건을 최적화하기 위해서는  단백질/펩타이드의 수의 증가와 함께 정량성을 반드시 고려해야 됩니다.  FAIMS의 경우 CV값별로 DIA를 수행해야 함으로 FAIMS가 없는 상태에서 하는것보다는 한 Cycle을 완료하는데 더 시간이 많이 소요됩니다.  

 

Data Point

정량성을 고려할때 체크해야할  것중에 하나가 Data point입니다.  보통 8~10 point가 되면 좋습니다.  Isolation window값이 적어질수록 그리고 CV값의 수가 증가될수록 검출되는data point는 줄어들게 됩니다.

 

Qualbrowser 에서 DIA data point 수 확인하기

Qualbrowser 에서 DIA data point 수 확인하기

 

이전의 실험에서 FAIMS가 없는 상태에서는 대략 25m/z Isolation window값에서 가장 좋은 결과가 나왔습니다.

 

Orbitrap Eclipse에서 DIA Isolation window값 정하기

Qualbrowser 에서 DIA data point 수 확인하기

 

• 아래 그래는  FAIMS를 장착한후 서로 다른 CV값에서 얻어진 100ng HeLa standard의 precursor 수 비교입니다. 예상대로 FAIMS의 기능으로 인해 CV값에 따라 상당한 차이가 있습니다. 

 

 

100ng HeLa, 20m/z isolation window, 1hr LC gradient. DIA

 

• 아래 그래프는 검출된 각각의 CV값에서 검출된 단백질과 펩타이드 수입니다. CV값별로 상당한 차이를 보입니다.

 

 

100ng HeLa, 20m/z isolation window, 1hr LC gradient. DIA

 

Dual CVs with 30, 40, 50m/z Isolation Window

• 아래는 100ng HeLa standard를 사용하여 FAIMS(1-hour LC)에서 두개의  CV값을 이용하여   30, 40, 50m/z에서 검출된 단백질과 펩타이드 수입니다. 검출된 단백질과 펩타이드의 수를 비교해보니 큰 차이는 없습니다.

 

 

• 아래는 Data point 수를 나타냅니다. 예상대로 isolation window 크기가 적을수록 data point가 줄어듭니다. 40m/z 이상이 되어야 data point값이 8 이상이 됩니다. (물론 이것은 HPLC 시스템의 성능에 따라 달라질수 있습니다. Data point만을 가지고 결정을 해야 된다면 최소 40m/z값을 사용해야 됩니다.

 

 

 

• FAIMS를 사용하지 않았을때는 20m/z isolation window를 사용해도 8 data point를 얻을수 있었습니다. 하지만  두 종류의 CV값을 사용했기 때문에 한 cycle을 끝나는데 시간이 더 소요 됩니다. 이로인해  Isolation window를 넓혀야 data point가 증가됩니다.  하지만 두  FAIMS로 인해 peptide complexity가 감소하게 됨으로 isolation window가 증가되더라도 MS2 스펙트럼은 그다지 복잡해지지 않습니다.  장단점이 동시에 존재합니다.

 

 

Triple CVs with 30, 40, 50m/z Isolation Window

• Triple CV값에서는 어떤 경향이 있는지 확인해보았습니다. 비교를 위해서 같은 조건에서 Double 와 Triple CV값을 사용하여 분석하였습니다.  아래 그래프는  2ug K562 digestion을 이용하여 Dual와 Triple CV값에서 30, 40, 50m/z isolation window를 이용하여 얻어진 단백질 및 펩타이드 수입니다. 검출된 단백질과 펩타이드의 수는 Triple CV 값을 사용했을때가 더 높습니다. 특히 펩타이드 수에서 상당한 차이를 보여줍니다. 

 

• 아래는 Data-point 의 수를 보여집니다. Triple CV값에서는 data point수가 정량분석에 적합한 수만큼 나오지 않습니다.  Triple CV에서 더 많은 수가 검출되었지만 DIA의 목적인 정량분석을 위해서는 Triple CV값보다는 Double이 더 좋은것 같습니다.  AGC값이나 MS2 resolution값들을 조절하면 검출수 혹은 data point의 향상이 있을수 있습니다.