Multi-phosphorylated standard peptides 검증

Phosphorylation 실험을 위해 standard 펩타이드를 구매후  간단히 피크를 확인해 해보았습니다. 3개의 sites에 phosphorylation이 된 tri-phosphorylated 펩타이드입니다 . 

 

• LC-MS/MS로 측정해보니 4개의 피크가 검출이 됩니다.  m/z를 계산해보면 3 charge에서 26.65 Da이 각각 차이가 납니다. Phosphorylation에 해당하는 79.96 Da입니다. 즉 Tri-phosphorylation외 non, mono-, di- phosphorylation이 동시에 존재합니다.  

• 시료준비과정이나 Ionization과정에서 phosphate가 하나씩 떨어질수 있습니다.  아니면 회사에서 시료를 발송하기 전부터 혼합된 시료일수도 있을듯 합니다. 하지만  판단하기가 어렵습니다

 

•  4개의 펩타이드의 Retention time을 확인해보니 조금씩 차이가 납니다. 거의 차이가 나지는 않지만 Phosphorylation이 많이 된 펩타이드일수록  앞쪽에서 용리되었습니다.  Phosphorylation이 되면 hydrophilicity의 증가로 인해 일찍 용리되는 이론과 일치합니다.  LC에서 분리가 되었다는것은 ionization 과정에서 떨어진것이 아니라 그전에 이미 서로 다른 펩타이드가 존재했다고 생각할수 있습니다. 물론 그 시점이 어디인지는 알수 없습니다.  Phosphorylation이 되면 retention time이 꽤 차이가 날텐데 이 경우에는 아주 미비합니다. 그리고 non-phophorylation form은 오히려 mon-에 비해 약간 일찍 용리된것 같습니다.  해석하기가 쉽지 않습니다.

 

 

• 건조된 상태로 배송이된 시료를 0.1% TFA로 녹여서 LC-MS/MS로 분석하였는데 이 과정에서 떨어질수 있는것일까요?
• 회사에 QC 자료를 요청하였습니다. 회사에서 가지고 있는 데이타는 HPLC-UV data가 전부였습니다. 한개의 peak로 검출되었기 때문에 시료에는 아무런 이상이 없다는 답변을 받았습니다.
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High-flow rate HPLC-UV Chromatogram

 

 

 

•  Nano-LC의 크로마토그램을 보면 큰 차이는 없지만 용리시간의 차이를 보입니다. 하지만 회사의 일반 HPLC에서는 4개의 펩타이드가 동시에 용리되었을수도 있을듯합니다.  또한  UV detector 는 이 4가지의 펩타이드를 구분을 할수가 없습니다. 그러므로 회사에서 제공한 결과로는 100% 한개의 펩타이드라고 말하기가 어려울것 같기도 합니다.  질량분석데이타가 있으면 좋겠지만 첨부된 질량분석데이타 (MALDI-TOF)는  현재 Lot#와 상관없이 오래전의 결과입니다. 

 

•  오히려 시료안에 4개의 펩타이드가 존재하는것이라면 좋겠네요. 4개의 서로 다른 Phospho-peptides를 standard로 사용할수 있습니다.