시료주입 양에 따른 단백질/펩타이드 수의 변화

앞의 글에서  시료전처리과정에서 30~40%의 손실이 있을수 있다는것을 확인하였습니다. 물론 상황마다 다르기 때문에 정확한 양은 알 수 없습니다. 그러나 아마 생각하는것보다 많은 양의 손실이 있을 수도 있을수 있을듯 합니다.

보통 75 µm x  25cm 컬럼에 1 혹은 2ug을 주입합니다. Nano column의 용량에 제한이 있기 때문입니다. Peak 모양이 퍼지기 전까지 최대한 주입하면 상관없습니다. 하지만 최대한의 양을 계속 주입하다보면 컬럼에 손상이 생실수도 있습니다.   긴 컬럼을 사용하면 더 많은 양을 주입할수 있습니다. 만약 Trap-column을 사용하게 되면 Trap-column의 용량도 고려해야 합니다.

 

아래는 보통 주입하는 양의 범위에서 시료의 양에 따라 단백질과 펩타이드의 수가 어떻게 차이나는지 확인해보았습니다.

CoAnn사의 self-packing column (75 µm ID)에 3 µm C18을 충진하여 40 cm 길이의 컬럼을 사용하였습니다.

 

 

아래는 시료양에 따른 크로마토그램입니다. 시료의 양이 증가함에 따라 전체 Intensity는 약간씩 증가합니다. 크로마토그램도 약간씩 변화가 있습니다.  동일한 양을 두번씩 주입했는데 같은 양에서는 Retention time의 변화가 없었습니다.  동일한 시료를 주입하더라도 양이 증가될 경우 C18 과의 상호작용에 약간의 차이가 생김으로 retention time에 차이가 생길수 있습니다.  정량분석에서 동일한 양을 주입해야 하는 이유이기도 합니다.

 

  

PD 3.0으로 분석후 얻어진  Abundance 의 분포도입니다. 0.1 µg에서 1 µg까지는 어느정도 증가하지만 그 이상은 큰 변화가 없습니다.

 

 아래 그래프는 시료양에 따라 검출된 단백질과 펩타이드 수입니다. 0.1µ에서 1 µg까지 약간 증가를 보이지만 1 ~ 4 µg 사이에는 큰 변화가 없습니다.

 

 m/z 576.2890 (z=2)에 대한 XIC 입니다. 시료의 양이 증가할수록 약간의 피크가 넓어지지만 큰 차이는 없는듯 합니다. 이것이 단백질의 검출 수에 영향을 줄 수 있는지 잘 모르겠네요

 

 

위의 결과를 봤을 때는 현재 시스템조건에서 1µg 이상에서는 시료의 양을 증가시키더라도 단백질/펩타이드 수에는  큰 영향이 없는 것 같습니다. 시료의 양이 제한이 없다면 많은 양을 주입해도 상관은 없을 것 같지만  시료의 양을 적게 주입하였다고 검출수가 확연히 줄어드는 건 아닌 것 같습니다. 물론 정량분석실험에서는 또 다른 차이가 있겠지요